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1970-01-01 09:00:00 | Hit : 14611 | Vote : 4889

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Guilt-by-association goes global

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"guilt-by-association"의 정의

어떤 단백질이 무슨 기능을 할 것이냐에 대한 단서는 이미 기능을 알고 있는 다른 단백질과 상호작용을 하는지 여부를 살펴봄으로써 알 수 있을 것이다. 이러한 원리를 "guilt-by association"이라고 한다.

Levels of gene function analysis

전체 게놈의 DNA 서열을 바탕으로 예측한 유전자 산물의 기능을 밝혀내기 위하여, Functional genomics는 다음과 같은 다양한 수준에서의 연구를 수행한다.

DNA microarray를 사용한 transcriptome분석은 유전자 기능에 관한 엄청난 양의 정보를 제공하지만, mRNA는 유전정보의 transmitter일 뿐 실제로 기능을 수행하는 것은 아니다. 그러나, proteome이나 metabolome의 광범위한 연구를 위해서는 transcriptome 연구에 비하여 기술적인 면의 발전이 요구된다. 현재까지의 2-Dimensional gel electrophoresis와 peptide mass fingerprinting기법을 사용한 classical proteomics는 기능을 분석하는 데 있어서 어쩔 수 없이 많은 정보를 잃어 버리게 되는데, 그 중 하나로 단백질들을  denaturing condition에서 분리하기 때문에 protein-protein interaction에 대한 정보는 얻을 수 없게 되는 것이다.

이에 보완적인 approach로서 "guilt-by-association"이 있다. 이는 기능이 알려져 있지 않은 단백질이 이미 기능이 알려진 단백질과 상호작용함을 발견해 내는 일로서, 새로운 유전자 산물의 기능에 대한 중요한 단서를 제공해 주게 된다.  이 분석은 proteome분석과 달리 단백질의 상대적인 양을 조사하는 것이 아니라 서로간의 potential interaction을 살펴보는 방법을 이용한다.

Two-hybrid analysis

two-hybrid analysis는 transcriptional activator의 DNA binding domain과 activation domain대한 coding sequence를 나누어 각각 서로 다른 벡터에 클로닝 함으로써 시작한다. 찾고자 하는 단백질의 파트너가 되는 부분을 bait라 하고 DNA binding domain에 결합시킨다.  bait와 상호작용하게 될 부분을 prey라고 하며 activation domain에 결합시킨다.  yeast는 a와 α라는  두 가지 sex(성)을 갖는다. 따라서, bait와 prey는 mating함으로써 같은 yeast 세포에 쉽게 도입할 수 있다. 만약, 두 단백질이 서로 물리적으로 상호작용한다면 DNA binding domain과 activation domain이 아주 가깝게 위치 함으로써 transcriptional activator가 새롭게 구축되어 reporter 유전자를 turn-on함으로서 색깔의 변화를 유발시키게 된다.

S. cerevisiae의 전체 게놈 서열이 밝혀짐에 따라 two-hybrid approach를 yeast전체 6000여개의 단백질 사이의 상호작용을 연구하는 것이 가능하게 되었고 실제로 university of Washington과 CuraGen이라는 생명공학 회사가 공동으로 이 연구를 추진하여 결과를 Nature (403)의 623 page에 발표하였다. Uetz et al은 두 가지 서로 다른 전략을 이용하여  yeast 단백질의 광범위한 protein-protein interaction을 조사하였다.

1. array screening

각각 다른 prey를 발현하는 6000개의 yeast colonies를 microtiter plate에 심은 후, 192개의 bait를 발현하는 strains을 array에 있는 각각의 member와 mating시킴으로써 positive interaction을 찾는 방법이다.

2. library screening

6000개의 서로 다른 prey를 6000개의 서로 다른 bait와 한꺼번에 mating시킨 후, positive interaction을 스크리닝해 내는 방법이다.

1번의 방법에 비해 2번이 훨씬 대량의 상호작용을 한꺼번에 조사할 수는 있으나, 12개의 bait에 대하여 1번은 48개를 2번은 14개의 가능성 있는 파트너를 찾아냄으로써 1번이 좀 더 효과적인 방법으로 파악된다.

Uetz et al의 분석은 다음과 같은 세가지 양상을 발견하였다.

1. 기능이 알려진 단백질과 알려져 있지 않은 단백질과의 상호작용을 통하여 모르는 단백질의 기능을 유추할 수 있다. 예를 들어, 두 단백질이 ornithine aminotransferase와 상호작용한다면 두 단백질은 arginine 대사와 관련이 있을 것이다.

2. 지금까지 같은 생물학적 프로세스내에서 발견되지 않은 상호작용을 발견할 수 있다. 예를 들어, Cks1(cyclin-dependent kinase)는 서로 다른 B-type cyclins과 상호작용함으로써 Cyks가 B-type cyclins들로 하여금 yeast cell cycle을 시작하게 하는 Cdc28kinase를 조절하게 함을 알 수 있게 되는 것이다.

3.어떻게 개개의 생물학적인 사건들이 더 큰 세포 내 프로세스로 통합되는지 보여준다. 예를 들어, Msh5(yeast에서 DNA cross-over를 푸는데 필요)는 double-strand break를 형성하는데, 그리고 meiotic spindle의 두 끝을 형성하는데 필요하다. 그리고, 이들 중 한 단백질은 다 synaptonemal complex를 생성하는데 필요하다.

two-hybrid analysis의 한계 및 전망

Two-hybrid analysis는 단백질 사이의 potential interaction (가능한 상호작용)은 보여주지만 이들 상호작용이 실제로 일어나는 생물학적인 context는 제공해주지 못한다. 즉, 어떤 단백질의 상호작용은 특정  physiological condition에서만 일어나는 경우도 있을 것이고, 극단적인 경우로는 상호작용이 서로 분리된 cellular compartment에서 일어나기 때문에 실제로는 일어나지 않는 것일 수도 있다.

앞서 classical proteomics는 cellular context에 따른 단백질의 상대적인 양의 변화는 보여주지만, 단백질 상호작용에 관하여는 보여 줄 수 없는 한계가 있음을 언급하였다. two-hybrid는 이와 반대로 cellular context에 관한 정보를 보여줄 수 없는 단점을 갖는다. 따라서, 새롭게 발견되는 단백질에 대한 기능을 분석하기 위해서는 two hybrid analysis와 함께 protein-protein interaction을 해치지 않는 proteomics기법을 개발하는 것이 필요하고,  동시에mass-spectrometry와 bioinformatics와 같은 분석 기법을 필요로 한다.

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