안녕하세요. 경희대 생명과학부 유전공학전공 홈페이지에 방문해주셔서 감사합니다.
현재 동문회 메뉴에 대한 업데이트를 계획 중에 있습니다.
동문회 메뉴에서 가장 주된 메뉴는 아마도 동문회 주소록이 아닐까 합니다.
부족한 실력에 어떻게든 졸업한 동문 선배님들과 재학생간의 원활한 연결을 위한 의도로 시작했지만,
검색기능에 대한 부족한 옵션과 각 동문회원의 빈약한 정보로 인해 그 기능을 다하지 못하는 것 같습니다.
동문선배님과 경희대 유전공 재학생 학우님들의 동문회 주소록 수정을 위한 조언을 구합니다.
어떤 정보가 추가 되었으면 좋겠고, 또한 검색은 어떻게 되면 간편하고 유용할 것 같은지 의견을 듣고자 합니다.
아래의 게시판에서 의견을 수렴하고 있습니다. 많은 참여 부탁드립니다. 의견수렴 게시판 가기!
1. Gene cloning을 위한 준비
1) 실험준비
gene cloning : 동일한 유전자의 집합을 만드는 과정
(1) 분자생물학 실험실 안전관리
a. 화학물질
실험실내에서는 여러 가지 유해한 화학물질들이 사용되는데 각각의 시약에 따른 취급요령과 주의 사항 등은 시약의 Material Safety Data Sheets(MSDS)나 시약용기에 표시된 내용을 주로 하여 반드시 지키도록 노력하여야 한다. 분자생물학 실험실에서 특별히 주의해야 하는 화학물질 등은 다음과 같다
- Phenol : 화상
- Acrylamide : neurotoxin(신경독소)
- Ethidium bromide : carcinogen(발암물질)
이와 같은 유해한 화학물질은 항상 장갑을 사용하고 입으로 pipetting하는 등의 위험한 행동을 해서는 안 되며 적절한 용기에 버려야 한다.
b. RadioActivity
동위원소를 취급하는 실험실에서는 동위원소 사용 시 항상 Dosimeter (선량계 : 동위원소 등의 방사능을 측정하는 기계) 를 사용해야 하고 방사능 취급 장소에 주기적으로 wipe test를 실시해서 그 안전성을 확인해야 한다. wipe test시 200dpm이 넘는 곳은 즉시 decontamination이 이루어져야 하며 그 후 다시 test 한다. 분자생물학 실험실에서 주로 사용하는 방사성물질은 32P로서 beta-ray를 방사하므로 항상 glove를 착용하고, lab coat를 입거나 차폐 막 뒤에서 작업한다. 동위원소를 절대로 입으로 pipetting 하지 않으며 동위원소 취급 장소에서는 절대 먹거나 피거나 바르거나 마시지 않는다. 32P는 반드시 plexiglass shield 뒤에서 취급하며 보호안경도 반드시 착용한다. 동위원소로 오염된 검사물 들은 반드시 적절한 방법에 따라 폐기하고 작업이 끝난 후에는 항상 작업장소의 오염여부를 확인한다.
c. Ultraviolet Light
UV에 정도이상 노출되면 급성 안염을 일으킬 수 있는데 사람의 망막은 UV light를 감지하지 못하므로 UV에 노출된 후 30분에서 24시간 후에나 심각한 눈의 손상이 왔다는 것을 알게 되기 때문에 PCR product등을 전기영동 한 후 UV로 관찰할 때는 반드시 보호안경을 써야 한다.
d. 전기안전
DNA의 전기영동 시에 사용되는 전압은 감전사를 일으키기에 충분히 하므로 전기영동 후 gel을 제거할 때나 기타 전기영동 buffer reservoir를 취급할 때는 연결선이 빠져있나 반드시 확인한 후 하도록 하고 젖은 손으로 만지지 않도록 주의한다.
58.456 (NaCl 분자량) g X 3 moles X 0.1 liter = 17.53 g
따라서 17.53 g을 물에 녹여 최종 volume이 100 ㎖가 되도록 하면 된다.
② Percent % 농도
Percent (w/v) : weight (g)가 100 ㎖속에 녹아있는 용액
Percent (v/v) : volume (v)이 100 ㎖속에 섞여 있는 용액
ex) 1% agarose in TAE buffer
1 g의 agarose를 TAE로 녹여 100 ㎖로 만들면 된다.
③ "X"배 stock
5X, 10X 등의 "X"배 용액은 working 용액보다 5배, 10배의 농도를 가진 용액으로 실험에
사용할 경우에는 1X로 희석해 사용한다.
ex) 20 ㎕의 restriction enzyme mixture
10X buffer를 2.0 ㎕ 넣고 최종 volume이 20 ㎕가 되도록 한다.
④ Stock solution으로 Working solution 만들기
분자생물학 실험실에서 사용되는 시약은 몇 가지의 stock solution을 이용하여 working
solution을 만드는 경우가 많다.
ex) 1M Tris용액과 0.5 M EDTA를 이용하여 TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA)
100 ㎖를 만든다고 가정하면
Ci x Vi = Cf x Vf ------------ 공식을 이용한다.
C : concentration V : volume
i : initial f : final
풀이) 1 M Tris용액 : 1000 mM x ? ㎖ = 10 mM x 100 ㎖
0.5 M EDTA용액 : 500 mM x ? ㎖ = 1 mM x 100 ㎖
→ Graduated cylinder에 1 M Tris용액 1 ㎖와 0.5M EDTA용액 0.2 ㎖를 넣고 100 ㎖ 선까지 증류수로 채운다.
b. 시약제조 순서
실험에 따라 필요한 시약의 제조 시 주의사항과 사용해야 할 화학물질의 주의사항을 숙지하고 필요한 화학물질의 양만큼 chemical balance를 이용하여 잰다. 무게를 잰 화학물질을 stir bar가 들어있는 적절한 크기의 비이커에 담고 최종 volume보다 조금 모자라도록 3차 증류수를 채운다. 잘 녹인 후 graduated cylinder등에 옮겨 정확히 최종 volume까지 물을 채운다. 단, agarose등을 녹일 때는 기벽에 많이 묻으므로 용기를 옮기지 않는다.
특정 pH로의 조절이 필요한 경우 새로 calibration한 pH meter를 이용하여 pH를 맞춘다.
121°C, 20분 동안 autoclave (고압증기멸균) 한다. SDS처럼 autoclave가 불가능한 시약은 0.22 ㎛ filter를 이용하여 filtration 한다. bacterial culture용 media의 경우 당일 autoclave한 것을 사용하고 사용하기 전 육안으로 오염여부를 확인한다.
Working solution을 만들어 사용할 때는 가급적이면 autoclave된 물을 사용하도록 한다.
(3) 초자기구 및 각종용기
분자생물학실험실에 사용되는 초자기구는 아주 깨끗해야 한다. 세균 등이 오염되거나 세척제 찌꺼기 등이 남아 있으면 핵산을 degradation 시키거나 특정반응을 방해할 수 있으므로 세척한 후 반드시 증류수로 잘 헹구어서 멸균하거나 150°C oven에서 5분 정도 건열살균한다. Plastic 역시 많이 사용하게 되는 용기재료로 사용 목적에 따라 그 재질이 달라져야 하는데 autoclave에 견딜 수가 있어야 하며 polypropylene으로 된 용기는 불투명하지만 phenol, chloroform등의 시약을 담을 수 있는데 반해 polycarbonate나 polystyrene등으로 만들어진 용기는 투명하지만 여러 가지 유기화학물질을 담을 수 없다.
Vortexor : 물질을 섞는데 사용
Chemi-balance : 화학저울
Magnetic stirrer : 시약을 녹일 때 자석을 이용하여 섞어주는 기구
Bacterial hood : 기계 안에 다른 잡균들이 가라앉지 못하게 바람이 나오면서 문을 절 반쯤 내리고 손만 넣어서 실험하는 장비
증류기 : 실험실의 시약은 3, 4차 증류수로 만듬
Ice-maker : 얼음을 만들어내는 장비
원심분리기
Desktop microcentrifuge
Microcentrifuge with refrigerator (4℃ centrifuge)
High speed centrifuge (conical tube 사용가능)
Ultracentrifuge
냉장고
4℃ refrigerator
-20℃ refrigerator
-70℃ refrigerator (deep freezer)
Micropipette : 분자생물학 실험의 주된 도구
※ 마이크로 파이펫의 사용법
① 각 파이펫의 눈금 범위 밖으로 돌리지 않는다.
② 파이펫 위의 단추를 누르면 걸리는 곳까지가 정확한 용량. 더 눌러지는 것은 남아있는 잔류 용량을 모두 내보내는 것. (따라서 용액을 빨아 들이 전에는 용액 밖에서 한번 딸깍 걸리는 곳까지만 단추를 누르고 용액 속에 넣어 용액을 취하며, 용액을 내보낼 때에는 한번 딸깍 걸린 후에 좀 더 밀어내서(끝까지) tip 안에 남아 있는 용액을 모두 내보낸다.)
③ 용액을 취할 때와 옮길 때는 버튼을 조작을 천천히 한다.
④ 용액이 담긴 상태로 파이펫을 거꾸로 세우지 않는다. (용액 속의 DNA가 파이펫 에 묻지 않도록 주의하고 유기 용매를 다룰 때는 특히 조심)
DNA(deoxy-nucleosidetriphosphate)는 sugar, base (purines과 pyrimidines), phosphoric acid의 세 부분으로 구성된 nucleotide monomer가 위, 아래로 연결된 이중나선 모양으로 phosphate group 이 있는 쪽이 5' 방향, sugar 가 있는 쪽이 3' 방향이다.
(1) Sugar(당)
DNA내의 당은 탄소원자 5개를 가지고 있는 오탄당이며 2'-deoxyribose라고 부른다.
DNA내에서 pentose ring 형태로 존재하며 2번 탄소에 hydroxy group(-OH)대신에
hydrogen이 치환되어 있는 형태이다.
(2) Nitrogenous Base(염기)
1개 혹은 2개의 환형 구조의 물질이 pentose ring의 1번 탄소에 붙어있는 adenine이나
guanine이 붙은 nucleotide를 purine, cytosine이나 thymine이 붙은 것을 pyrimidine이라
한다.
(3) Phosphate(인산)
sugar ring과 base만 있는 것을 nucleoside, 여기에 인산기가 붙으면 nucleotide라 한다. 3개까지의 phosphate가 붙을 수 있는데 1개가 붙은 것을 nucleoside monophosphate(NMP),
2개는 nucleoside diphosphate(NDP), 3개가 붙은 것을 nucleoside triphosphate(NTP)
라 한다.
A : 2'-deoxyadenosin 5'-triphosphate (dATP)
G : 2'-deoxyguanosin 5'-triphosphate (dGTP)
C : 2'-deoxycytidine 5'-triphosphate (dCTP)
T : 2'-deoxythymidine 5'-triphosphate (dTTP)
(4) Watson과 Cryck의 DNA 모형
DNA의 2중 나선구조는 2개의 polynucleotides로 구성되어 있는데 분자의 바깥쪽에는
sugar-phosphate backbone이 있고 안쪽에 염기들이 쌓여있다. 서로 다른 가닥의 염기들
끼리 즉, A와 T사이에는 2개, G와 C사이에는 3개의 수소결합이 존재한다. 이중나선의 두 가
닥이 서로 방향이 틀린 역 평행 방향으로 이러한 구조는 DNA를 안정하게 한다.
(5) Genomic DNA, mRNA, CDS(coding sequences)와의 관계
진핵생물의 유전자는 exon과 intron으로 구성되어 있고 첫 exon 앞에는 이 유전자의 발 현을
조절해주는 promoter가 존재한다. mature mRNA가 되면 exon만이 연결된 모양이 되는데
이 mRNA도 모두 단백질로 연결되는 부분이 아니고 앞쪽과 뒤쪽에 codon과는 무관한
5'-nontranslating region 과 3'-nontranslating region 이 존재하며
(untranslated-UTR), 그 사이에 open reading frame(ORF)이 있다. ORF의 시작은
AUG(initiation codon), 끝은 UGA, UAG, UAA(termination codons)이다. 유전자의 암
호 인 코돈(codon)은 염기 3개씩으로 이루어져 있고 항상 methionine을 코딩하는 AUG로 시
작하고 UGA, UAG, UAA로 끝난다.
2.Gene clonong의 과정
1) 유전자준비
유전자를 얻는 방법에는 Library screening 과 PCR (polymerase chain reaction) 방법이 있다. Library screening은 처음으로 어떤 유전자를 cloning할 때 쓰는 방법이며 이미 알려진 유전자의 유전정보를 이용한 경우는 PCR을 이용한다.
(1) GenBank에서 유전자 검색
GenBank의 주소는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html이며 GenBank 에서는 mRNA이건 DNA이건 ACGT를 사용해서 표기한다. RNA라고 해서 U를 쓰지 않고 cDNA sequence나 mRNA sequence나 모두 같다. 또한 mRNA에서 유래하는 cDNA라고 해서 mRNA와 상보적인, complementary sequence를 쓰지 않고 방향은 무조 건 5' 으로 부터 3' 쪽으로 쓰며 double strand에서의 sense strand 만을 표기한다.
(2) DNA 분리
① 포유동물세포로부터 염색체 DNA의 분리 (conventinal method)
a. 실험방법
※ 실험재료
Phosphate-buffered saline
[ PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM sodium phosphate(dibasic), 1.4 mM potassium phosphate (monobasic) ]
[ 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1 M EDTA, 20 ㎍/㎖ pancreatic RNase A, 0.5% SDS
Acid citrate dextrose solution B ]
- Citric acid 0.48 g, sodium citrate 1.32 g, glucose 1.47 g 을 증류수에 용해시켜 100 ㎖ 로 희석한다.
Proteinase K
[ Proteinase K powder를 10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.4% SDS에 녹인다. 증류수에 녹여 사용하여도 무방 ]
① DNA를 분리하고자 하는 재료에 따라 다음과 같은 과정을 실시한다.
1) 세포배양기에서 단층으로 자란 세포
차게 한 PBS (phosphate-buffered saline) 용액으로 단층의 세포들을 두 차례 세척한다. 세포의 종류에 따라 policeman으로 긁거나 trypsin, trypsin-EDTA로 처리하여 1～10 ㎖의 차게 한 PBS 용액으로 부유 시킨 후 500 xg에서 5분간 원심분리 한다. 상층액을 제거하고 적당량의 PBS를 가하여 침전된 세포를 다시 세척한다. pH 8.0 인 TE 완충용액으로 세포를 부유 시킨 뒤 (5X107 세포 당 1 ㎖ 사용) 새 conical tube에 옮기고 세포 부유액 1 ㎖ 당 10 ㎖의 추출용액을 첨가하고 37℃에 1시간 이상 보관해 둔다.
2) 세포 배양액 내에서 자란 세포 (배양기 바닥에 붙지 않고 떠서 자라는 세포)
배양액을 conical tube에 옮긴 후 4℃에서 900 xg로 5분간 원심분리 하여 세포를 침전시킨다. 이후의 과정은 위와 같다.
3) 혈액
Acid citrate dextrose solution B 3.5 ㎖가 들어 있는 시험관에 20 ㎖의 신선한 혈액을 받는다. 이 혈액은 0℃에서 수일간 보관하거나 혹은 -70℃에서 수개월 보관한 후 DNA를 분리하여도 무방하다. 신선한 혈액인 경우에는 1,300 xg로 15분간 원심분리 하여 상층의 혈장을 제거하고 pasteur pipette을 사용하여 buffy coat를 새 시험관으로 옮긴다. Buffy coat를 20 ㎖의 PBS 용액으로 부유 시킨 후 같은 방법으로 원심분리 한 다음 반복하여 buffy coat를 분리한다. 추출용액 15 ㎖에 buffy coat를 부유 시키고 37℃에 1시간 이상 보관해 둔다. 얼린 혈액일 경우에는 수욕에서 녹인 후 동량의 PBS 용액을 첨가하여 혼합한 다음 3,500 xg로 원심분리 하여 상층액을 제거한다. 이때 적혈구는 용혈 되어 상층에 존재하게 된다. 침전물을 15 ㎖ 의 추출용액에 부유 시키고 37℃에 1시간 이상 보관해 둔다.
4) 조직
Waring blender의 스테인리스 컵에 액체질소를 넣고 여기에 조직을 갈아서 넣는다. 최고속도로 조직을 갈아서 분말이 되도록 한 다음 액체질소를 증발시킨다. 적당한 크기의 삼각플라스크에 조직 부피의 10부피로 추출용액을 넣고 여기에 조직 분말을 조금씩 첨가하면서 혼합하여 조직 분말이 용액 내에 고르게 부유 되도록 한 다음 37℃에 1시간 이상 보관해 둔다.
② Proteinase K 용액을 최종농도가 조직과 세포는 1 ㎎/㎖, 혈액의 경우에는 100 ㎎/㎖ 이 되도록 첨가하고 유리막대를 이용하여 조심스럽게 섞는다.
③ 용해된 세포 용액을 50℃ 수욕에서 간헐적으로 섞어 주면서 3시간 동안 반응시킨다.
④ 용액을 상온에서 식힌 뒤 tube로 옮기고 동량의 phenol / chloroform / isoamylalcohol (25:24:1)을 첨가하고 뚜껑을 막은 뒤 조심스럽게 천천히 상온에서 10분간 수용액 층과 유기용매 층을 섞는다.
⑤ 상온에서 5,000 xg로 15분간 원심분리하여 수용액 층과 유기용매 층을 분리한다.
* Phenol은 pH 8.0 인 Tris-Cl 용액으로 평형 시킨 후 사용하여야 한다. 그것은 phenol의 pH가 8.0 이면 유기용매 층과 수용액 층 사이에 DNA가 걸려 채취하기 곤란한 경우를 방지 해 주기 때문이다.
⑥ 수용액 층을 새 원심분리관으로 옮긴다.
* DNA의 농도가 높으면 점도가 매우 크므로 조심해서 다루어야 한다. 즉 수용액 층을 옮 길 때 DNA 용액을 천천히 빨아올려서 중간층의 물질이 따라 올라가지 않도록 해야 한다. 중간층의 물질이 따라 올라가면 phenol : chloroform 추출을 다시 한번 시행해야 한다. 상층액을 뜨는 것이 용이하지 않으면 긴 파이펫을 이용해 하층액을 제거해도 좋다.
⑦ 단백질이 완전히 제거되었다고 생각할 때까지 phenol : chloroform 추출을 반복한다.
* 단백질이 제거되었는지의 여부는 흰색을 띠고 중간층에 모여진 물질이 있는지 없는지를 보아서 결정한다.
⑧ 약 200 kb 이상의 DNA를 분리하고자 할 경우에는 추출한 DNA 용액을 4°C의 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA 용액에서 투석을 실시한다. 투석된 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA 용액의 흡광도가 270 nm 에서 0.05 이하가 될 때까지 계속한 후 pH 8.0인 TE 용액에서 4시간 이상 투석한다.
⑨ 약간의 기계적 손상을 감수할 경우에는 DNA 용액에 10 M ammonium acetate 용액을 최종농도 2.5 M이 되도록 첨가하고 4℃에 보관되어 있는 2.5배 용량의 ethanol을 넣으면 즉시 DNA가 침전된다.
* 10 M ammonium acetate 대신 pH 5.5, 3 M sodium acetate 0.1 부피를 첨가해도 된다.
⑩ 실타래처럼 엉기는 물질이 염색체 DNA로 이것을 건져내어 ethanol이 날아갈 때까지 실 온에 두어 말리거나 진공펌프를 연결하여 건조시킨다.
⑪ DNA를 건져낸 후 남은 용액은 12,000 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리 한 후 상층액 을 완전히 제거하고 나면 DNA를 더 얻을 수 있다.
⑫ TE 완충용액을 적당량 (5 ㎎) 첨가한 후 DNA가 충분히 녹을 때까지 4℃에 보관했 다가 분광광도기로 정량 한 다음 실험에 이용한다.
* 분광광도기로 260 nm와 280 nm에서 DNA 용액의 흡광도를 측정하였을 때 A260/A280 의 값이 1.75 이상이 되어야 한다. 이보다 낮으면 단백질이 포함되어 있음을 의미하므로 phenol : chloroform 추출을 다시 시행하여야 한다.
* 260 nm에서 흡광도가 1일 때 double strand DNA는 50 ㎍/㎖, single strand DNA는 33 ㎍/㎖, RNA는 40 ㎍/㎖을 의미한다.
6. 여기에 10 ㎖ 의 phenol / chloroform / isoamylalcohol (25:24:1)을 첨가하고 실온에서 1 시간 천천히 mixing한다.
7. 8000 rpm으로 1시간 원심분리 시킨 후 상등액(supernatant)을 30 ㎖ corex tube 2개에 나눠 넣는다.
8. 여기에 2배 부피의 100% cold Et-OH을 첨가하고 -20℃, overnight 한다.
9. 2500 rpm으로 5분 원심분리하고 상등액은 버린다.
10. 침전물에 10 ㎖의 70% Et-OH로 washing한다.
11. 2500 rpm으로 5분 원심분리하고 상등액은 버린다.
12. speed-vac.에서 pellets을 건조시킨다.
13. 3 ㎖의 TE (+ DNase-free RNase 60 ㎍/tube) 를 가해 37°C 에서 1시간 천천히 진탕배 양한다.
14. 3 ㎖의 phenol / chloroform / isoamylalcohol (25:24:1)을 첨가하고 37℃에서 30분 천 천히 진탕배양 한다.
15. 8500 rpm으로 50분간 원심분리 시킨 후 상등액을 얻는다.
16. 여기에 2배 부피의 Et-OH과 0.1 %의 3M sodium acetate를 넣고 -80℃에 10분 둔다.
17. 1000 g로 5분 원심분리 하여 상등액은 버리고 건조시켜 TE 에 녹여 사용한다.
- QIAamp kit를 이용한 염색체 DNA의 분리
이 방법은 혈액이나 조직에서 단 20분만에 DNA를 분리할 수 있다. 효율은 200 ㎕의 whole blood에서 6 ㎍ DNA, 200 ㎕의 buffy coat, 107 lymphocyte나 cultured cell에서 50 ㎍ DNA를 분리할 수 있다. 조직을 쓸 땐 25 ㎎ 조직에서 40 ㎍을 얻을 수 있다고 한다. 한 column 당 100 ㎍의 DNA까지 결합할 수 있고, 보통은 25 ㎎ sample (200 ㎕)에 맞게 설계되어 있으나 최소 1 ㎕, 최대 1 ㎖ (50 ㎎)까지 쓸 수 있다.
실험방법
1A. (혈액, 혈장, 혈청, buffy coat, body fluid, 임파구, 배양세포인 경우) 200 ㎕의 재료를 미세원침관에 옮긴다. 임파구나 배양세포는 107 세포를 200 ㎕의 PBS에 풀어 옮긴다. 배양세포가 단층세포일 때는 배양접시에 붙어있는 상태에서 PBS 1 ㎖로 두 번 세척하고 PBS를 200 ㎕를 첨가한 후 policeman으로 긁어 옮긴다.
* Sample이 200 ㎕ 이하면 PBS로 부피를 맞춘다.
* QIAamp spin column은 RNA와 DNA를 동시에 분리한다. RNA는 PCR 반응에는 별 영 향을 못 주지만, 다른 효소반응을 억제시킬 수 있다. 굳이 RNA를 제거하고 싶다면 RNaseA (20 ㎎/㎖)을 위 과정에서 20 ㎕ 첨가하고 2분간 상온에 둔 다음 과정 2를 진행 한다.
* 마지막 7 과정에서 필요한 추출용액 (증류수, TE용액)을 미리 70°C에 넣어둔다.
1B. (조직인 경우) 25 ㎎의 조직(비장은 10 ㎎)을 잘게 잘라 미세원침관에 넣고 ATL 용액을 180 ㎕ 첨가한다.
2A. (혈액, 혈장, 혈청, buffy coat, body fluid, 임파구, 배양세포인 경우) Kit에서 제공되는 QIAGEN protease(2 ㎎/㎖) 25 ㎕과 AL 용액 200 ㎕를 넣고 즉시 15초간 vortex하여 잘 섞는다.
* 이 과정은 세포를 파괴하는 과정이므로 즉시 균등히 섞는 것이 중요하다. 위 두 시약을 직접 섞지 말고 하나씩 첨가해야 한다.
2B. (조직인 경우) Proteinase K (not QIAGEN protease) 20 ㎕를 첨가하여 섞고 55°C에서 흔들면서 조직이 완전히 용해될 때까지 둔다. 대개 1～3시간 소요되며 밤새 두는 것도 좋다. 이후, RNaseA (20 ㎎/㎖) 20 ㎕를 첨가하여 상온에 2분 두었다가 AL 용액을 200 ㎕ 넣고 잘 섞는다.
3. 70℃에서 10분간 둔다.
4. Isopropanol이나 순수한 ethanol을 210 ㎕ 첨가한다.
* 혈액, 혈장, 혈청인 경우는 isopropanol을, 나머지와 조직은 ethanol을 쓴다.
5. Column을 collection tube에 설치하고 위 혼합액을 apply한 다음 뚜껑을 닫고 8,000 rpm 에서 1분간 원심분리 한다.
* Buffy coat나 임파구는 최고속도를 쓰는 것이 좋다.
6. 빠져 나온 용액을 버리고, 다시 설치한 다음 AW용액을 500 ㎕ 가하고 다시 원심분리 한 다. 이 과정을 한번 더 반복하고 빠져 나온 용액을 버린 다음, 그 상태로 다시 2분간 최고 속도로 원심분리 하여 남은 용액을 모두 제거한다.
* 위 과정을 거듭하여도 column의 가장자리 턱에 걸린 소량의 용액이 빠지지 않는다. 이를 흡입기를 이용하여 제거해야한다.
7. Column을 새 미세원침관(1.5 ㎖-microfuge tube)에 옮기고 미리 70°C에 넣어두었던 증류수나 TE, pH 8.0, 또는 AE 용액 200 ㎕ 첨가하고 1분간 두었다가 8,000 rpm에서 1분간 원심분리 한다.
* 용액을 첨가한 후 5분간 column 자체를 70°C에 두면 더 효율이 증가한다고 한다. 또한 위 추출과정을 한번 더 반복하면 15% 정도의 효율 증가를 기대할 수 있다.
(3) Polymerase Chain Reaction (PCR)
중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다. 중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105～108배까지 수 시간 내에 증폭시킬 수 있다, 이렇게 증폭된 DNA는 여러 실험에 이용하며, 실험 결과를 토대로 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.
※ 중합효소 연쇄반응이 이용되는 실험
① Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭
② 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning
③ DNA sequencing
④ 돌연변이 검사
⑤ 병인성 바이러스 및 박테리아 검출
⑥ 유전자의 footprinting
⑦ 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)
⑤ 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등
* PCR에서 필요한 재료는
① Template DNA : 증폭 대상이 되는 DNA
② 한 쌍의 primer : 증폭할 부분을 잡는 짧은 oligonucleotide
③ dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 nucleotide들
④ Taq polymerase : 열에 특별히 강한 유전자 합성효소
* PCR 의 원리
중합효소 연쇄반응은 다음의 세 단계로 이루어진다.
1) DNA의 변성(denaturation)
90℃～96℃로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94℃로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.
2) Primer의 결합(annealing)
50℃～65℃에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.
3) DNA의 합성(polymerization)
70℃～74℃에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000～4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려 가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히 (10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.
위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25～35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.
A. Genomic DNA로부터 특정 유전자 부위의 증폭
실험방법
1. 실험에 이용할 PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다.
① Template DNA (100 ng/㎕) 1 ㎕
② Upstream primer (12.5 pmole/㎕) 1 ㎕
③ Downstream primer (12.5 pmole/㎕) 1 ㎕
④ dNTP (dA, dC, dG, dT 2.5 mM-each) 2 ㎕
⑤ 10x PCR 완충용액 5 ㎕
⑥ 증류수 39 ㎕
⑦ Taq DNA polymerase (1 unit/㎕) 1 ㎕ (총 부피 50 ㎕)
* 10x PCR 완충용액 (100 mM Tris-Cl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15～20 mM magnesium chloride, 0.01% gelatin 또는 bovine serum albumin[BSA])은 효소에 딸려오는 것을 사 용하면 되지만, MgCl2의 농도를 변화시킬 필요가 있는 경우에는 Mg-free 완충용액을 사용해야 한다.
* 여러 명의 다른 환자 혈액에서 분리한 template를 같은 primer로 증폭하려 할 때에는 template를 제외한 다른 성분을 한꺼번에 섞은 PCR mix를 만들어서 쓰면 좋다.
* 위 반응은 단지 예일 뿐이며 모든 성분은 PCR 반응마다 여러 번 실험을 반복하면서 최 적 조건을 결정하여 사용해야 한다. 각 조성마다 고려해야 할 점과 주의사항을 아래에 따 로 정리하였다.
* 최근에 나오는 PCR 기계에 맞는 PCR 시험관은 크기가 작고 얇아서 열전도가 잘 된다.
* 중합효소 연쇄반응은 대단히 민감한 반응이다. 위의 여러 가지 시약들이 조금이라도 다른 물질에 오염되거나 더러운 tip을 쓰는 경우 false positive 반응이 나오는 확률이 아주 높 으므로 반드시 깨끗한 시약을 조금씩 덜어서 쓰도록 하고 오염이 의심되면 버려야 한다.
* 위 반응은 단지 예일 뿐이며 annealing 온도와 각 시간은 PCR 반응마다 여러 번 실험을 반복하면서 최적 조건을 결정하여 사용해야 한다.
* 옛날에는 혼합액 위에 증발을 방지하기 위해서 mineral oil을 얹어야 했지만, 최근의 많은 기계와 시험관은 이런 과정이 필요 없도록 뚜껑 쪽에서 가열하게 되어있다.
3. 반응이 끝나면 10～20 ㎕ 정도 반응액으로 전기영동을 실시하여 반응산물을 확인한다.
* 반응산물을 확인하기 위해서는 acrylamide gel보다 사용하기 편리한 agarose gel을 더 많 이 이용한다. 그러나, 100 bp 이하의 반응산물을 확인해야 할 경우에는 agarose gel 상에 서 구별이 어려운 경우 acrylamide gel (12%)을 사용하면 분명하게 확인이 가능하다.
※ PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점
1. Template DNA
선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA (cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안 된 경우에는 양이 적을 때 반응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다.
Chromosomal DNA인 경우 1 ㎍ 이내, plasmid DNA의 경우 100 pg～100 ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동 상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.
2. Primer
Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다. G+C 비율이 반정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물 내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기 전에 신중히 고려해야 할 것이다. Primer 합성은 염기서열을 적어 바이오니아 등의 회사에 의뢰하면 주문에 따라서 정제도 해준다. 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다. Primer의 양은 0.1～0.5 μM로 시행한다.
3. dNTP (deoxynucleotide triphosphate)
시약 상에서 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP(각각 100 mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20～200 μM 정도를 사용한다.
4. 10x PCR 완충용액
1) Magnesium
다음과 같은 여러 가지에 영향을 주는 중요한 요소이다.
① Primer가 template DNA에 결합하는 능력
② Template 및 PCR 산물의 변성온도
③ Product specificity
④ dNTP와의 결합
⑤ Taq DNA polymerase의 활동성
⑥ Primer-dimer artefact의 형성
a) 반응물 내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려 주어야 하고, dNTP나 template의 농도가 높으면 MgCl2의 농도를 높게 변화시켜야 한다.
b) 위에 나열한 ㎎의 기능 중 ①, ②, ③, ④는 농도가 높을수록 실험에 유익하고 ⑤, ⑥은 농도가 낮을수록 실험에 유익하므로 최적 농도를 유지할 수 있도록 노력해야 한다.
c) 반응이 잘 일어나지 않으면 0.5 mM부터 2.5 mM (때로는 8 mM까지)사이에서 농도를 변화시켜 가면서 최적조건을 찾도록 한다.
2) KCl
Primer가 target DNA에 결합하는 것을 도와주며, Taq DNA polymerase의 반응율을 높 여 준다.
3) Gelatin 또는 bovine serum albumin(BSA)
Taq DNA polymerase를 안정화한다.
일부 보고에 의하면 반응완충용액 내에 KCl이나 gelatin, BSA 등을 첨가하지 않는 것이 더 좋다는 설도 있다.
5. Taq DNA polymerase
Taq는 온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동 적정온도는 70°C～74°C이며 95°C에서 40분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다. 이 효소가 발견되기 전에는 Klenow 효소를 이용하여 매 cycle마다 효소를 첨가해 주면서 반응을 시켜야만 했다.
DNA 합성의 오차율은 1.1X10-4 bp로 DNA polymerase I의 오차율 (1.0X10-5)보다 높는데 이는 Taq DNA polymerase가 잘못 들어간 nucleotide를 삭제하고 다시 합성하는 proofreading 기능 (3'→5' exonuclease activity)이 없기 때문이다. 따라서 PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되더라도 반드시 확인과정을 거쳐야 한다.
한번의 반응에 사용하는 효소의 양은 보통 0.5-5 unit 정도인데 양이 너무 많으면 비특이 적인 DNA가 형성될 가능성이 많고, 너무 적으면 증폭 산물이 부족하게 되므로 최적 조건을 찾도록 노력해야 한다.
(4) PCR 산물의 전기영동 (electrophoresis)
PCR 산물의 전기영동은 agarose gel에서 시행한다.
전기영동(electrophoresis)의 원리는 시료를 gel에 넣은 후 전기를 걸어서 시료의 각 성분이 크기에 따라 다르게 움직이는 성질의 차이로 분리하는 것이다.
※ Agarose gel 전기영동 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들
① DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
② Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
③ DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA, linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.
④ 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
⑤ 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.
⑥ Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.
⑦ 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.
낮은 전압에서 선형으로 된 DNA 조각의 이동속도는 전압에 비례하지만 전기장에서 전류 의 흐름이 커짐에 따라 높은 분자량을 가진 DNA 조각의 이동속도는 빨라지므로 전압이 올라감에 따라 agarose gel에서 DNA 분리효과가 감소된다. 2 kb보다 큰 DNA 조각분리 를 최대로 하기 위해서는 agarose gel에 5 V/cm 이상의 전압을 부하 시켜서는 안 된다.
※ Electrophoresis buffer solution
Electrophoresis를 할 때 gel이 잠기는 buffer solution에는 TAE와 TBE가 많이 쓰인다. TAE는 주로 agarose electrophorsis에, TBE 는 DNA sequencing에 쓰인다. 조성은 아래와 같으며 미리 많이 만들어놓고 필요할 때마다 희석해서 부어서 쓴다.
* Commonly used electrophoresis buffers
Buffer Concentrated stock solution (per liter)
Tris-acetate (TAE) 50x
242 g Tris base
57.1 ㎖ glacial acetic acid
100 ㎖ 0.5 M EDTA (pH 8.0) - Generally used for agarose EP
Tris-borate (TBE) 20x
121.1 g Tris base
61.7 g boric acid
7.44 g Na2EDTA-2H2O - Generally used for DNA sequencing
※ Gel loading buffer
DNA 시료를 담는 loading buffer는 분자량이 큰 glycerol 등 무거운 물질이 함유되어 있어서 DNA가 든 시료를 gel 속에 잘 가라앉히고, 파란색을 내는 bromophenol blue가 들어 있어서 electrophoresis하는 동안에 진행상태를 눈으로 보아 알 수 있게 해 준다. 아래와 같이 몇몇 종류가 사용된다.
* Gel loading buffers (6 x)
I
0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
40% (w/v) sucrose in water
II
0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
15% Ficoll (Type 400) in water
III
0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
30% glycerol in water
IV
0.25% bromophenol blue
40% (w/v) sucrose in water
※ Agarose gel 만들기
Agarose gel은 1% (w/v) 전후로 만든다. 보통 100 ㎖ 정도를 만드는데 1 g의 agarose를 100 ㎖의 TAE buffer에 녹이면 된다. chemibalance에서 agarose를 잰 다음 플라스크에 넣고 buffer를 채운 뒤 전자렌지 (microwave oven)로 살짝 가열하면 녹아서 투명하게 되는데 몹시 뜨거워지므로 반드시 장갑을 끼고 플라스크를 잡아야 한다.
agarose가 식어서 굳기 전에 gel을 틀 (gel cast)에 부어넣는다. 틀은 플라스틱으로 되어 있고 comb을 꽂아서 시료를 넣을 공간을 준비해둔다. 약 15분 정도 지나면 gel은 굳어서 불투명하게 된다.
※ Electrophoresis 하기
PCR product (즉, DNA 시료) 20 ㎕와 6x gel loading buffer 4 ㎕를 섞은 후 조심스럽게 gel 판에 comb으로 만들어진 홈에 집어넣는다.
electrophoresis에 필요한 직류전류를 걸어주는데 붉은 색이 양극, 검은 색이 음극이다.
Bromophenol blue dye를 보면서 전기영동이 얼마나 되었는지를 판단하고, 이것이 gel 중간 쯤 갈 정도면 대개 적당한 정도가 되므로 gel을 꺼내서 Etidium Bromide 용액 속에 넣고 Etidium Bromide가 DNA 이중나선의 사이에 끼어 들도록 담가둔다. Etidium Bromide는 DNA에 끼어 드는 것으로 짐작할 수 있듯이 매우 위험한 발암물질로 주의를 요한다. 잠시 후 증류수통에서 여분의 Etidium Bromide를 씻어내고 자외선을 내는 판(UV transilluminator) 위에 올려놓는다. 자외선을 쬐면 DNA가 있는 부분이 형광을 발하게 되는데 Etidium Bromide가 끼어 들었기 때문이다.
폴라로이드 카메라로 사진을 찍는다.
A. Agarose gel 전기영동
실험방법
1. 깨끗하고 건조한 유리판 (또는 전기영동 기구에 꼭 맞게 만들어진 플라스틱판) 사방 모서 리를 주형의 모양이 되도록 테이프로 감은 후 수평으로 맞추어진 판 위에 주형을 둔다.
2. 전기영동 tank를 채우고 gel 제조에 이용하기 위한 전기영동 완충용액 (1x TAE)을 충분 히 준비한다. 다음 표를 이용하여 분리하고자 하는 DNA 크기에 해당하는 양의 agarose 와 완충액을 삼각 플라스크에 담는다.
* Amount of agarose in gel (%) Efficient range of separation of linear DNA molecules (kb)
0.3 5～60
0.6 1～20
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.4～6
1.5 0.2～3
2.0 0.1～2
* 1x TAE 용액은 먼저 50x 용액을 제조한 다음 희석해서 쓴다. 50x TAE 1 liter를 제조하 기 위해서는 Tris 242 g, glacial acetic acid 57.1 ㎖, 0.5 M EDTA, pH 8.0 100 ㎖를 녹 여 증류수로 1 liter까지 채운다.
* 전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약 간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문이다.
3. Microwave oven를 이용하여 agarose가 녹을 때까지 서서히 가열한다.
4. 용액을 60℃까지 식힌다.
5. Comb을 agarose를 모두 부었을 때 주형의 밑바닥으로부터 0.5～1.0 mm정도 떨어져서 위치하여 홈을 형성할 수 있도록 고정시킨다 .
6. 따뜻한 agarose 용액을 주형에 붇는다. Gel은 3～5 mm 두께가 되도록 하고 기포가 생기 지 않도록 주의한다.
7. 실온에서 20～30분 두어 gel이 완전히 굳은 후 comb과 테이프를 조심스럽게 제거한 다음 gel을 전기영동 tank안에 설치한다.
8. Gel을 1 mm 정도의 두께로 덮을 수 있을 정도로 충분한 양의 전기영동 완충용액(1x TAE)을 가한다.
9. DNA 시료를 전기영동용 loading 완충용액과 혼합한 후 pipette을 이용하여 잠겨있는 gel 의 홈에 혼합액을 조심스럽게 가한다.
* 전기영동용 loading 완충용액은 보통 6x로 제조하여 사용하는데 만약 DNA 용액이 20 ㎕ 이면 6x 용액을 4 ㎕ 첨가하면 된다.
typeII : (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll[type 400, Pharmacia]을 증류수에 녹인 것. Ficoll이 잘 안 녹으므로 50°C에 약 1시간 두어 녹인다)
* 전기영동 할 수 있는 DNA의 최고량은 DNA의 크기나 조각의 수에 따라 달라지며, ethidium bromide로 염색하여 사진 상으로 판독할 수 있는 최소량은 0.5 cm 넓이(일반 적으로 사용되는 넓이)의 홈 하나 당 2 ng 정도라고 한다. 0.5 cm 넓이의 홈에 DNA가 500 ng이상 존재하면 DNA 양이 너무 많아서 DNA 띠가 끌려 선명치 않게 나타나며, 이 현상은 DNA 크기가 클수록 심해진다. 보통 DNA 분자는 0.5 cm 홈 하나 당 100～ 200ng이면 분석 가능하다. 시료가 여러 가지 다른 크기로 된 많은 DNA 조각들로 구성 되어 있을 때 (예: genomic DNA를 제한 효소로 절단할 때) 홈 당 20～30 ㎕의 DNA를 가하여 분석할 수 있다.
* 한 홈에 가할 수 있는 최대 부피는 홈의 3차원적 크기에 따라 결정된다. 예를 들면 일반 적으로 사용되는 0.5 cm x 0.5 cm x 0.15 cm의 홈에는 37.5 ㎕를 가할 수 있다. 그러나, 옆의 홈에 가한 시료와 혼합되는 것을 막기 위하여 gel을 좀 더 두껍게 제조하거나 DNA 를 에탄올로 침전시켜 DNA 부피를 줄여서 가하는 것이 좋다.
* 시판되는 알려진 크기의 표준 DNA를 같이 전기영동 하여 모르는 DNA의 크기를 측정할 수 있다. 크기의 비교가 가능한 것은 linear DNA임을 주의한다. 주로 많이 사용되는 표식 자에는 1 kb ladder, 123 bp ladder, λ Hind III ladder (전기영동 패턴 보기) 등이 있다.
10. Gel tank의 뚜껑을 닫고 DNA가 양극 쪽으로 이동해갈 수 있도록 양극에 빨간 도선을, 음극에 검정 도선을 연결하고, 전극간의 거리 1 cm 당 1～5 V의 전압을 가한다.
* 전기영동을 시작하면 전기분해에 의하여 양극과 음극에서 기포가 발생하고 시약에 섞인 염료가 홈으로부터 이동해 가는 것이 보인다. bromophenol blue와 xylene cyanol FF가 적당한 거리만큼 이동해갈 때까지 전기영동을 시행한다.
11. gel을 ethidium bromide가 0.5 ㎍/㎖ 포함된 증류수나 1x TAE 용액에 30분 정도 담 가 염색하였다가 관찰한다.
* Ethidium bromide 원액은 증류수에 10 ㎎/㎖로 녹아 있는 용액으로, 이 용액의 보관은 빛이 차단된 용기에 담아서 실온에 보관한다. 이 원액을 0.5 ㎍/㎕로 희석해 사용한다.
※ 주의: Ethidium bromide는 강력한 발암물질이고 독성을 지니므로 이 염색액을 다룰 때 에는 반드시 비닐장갑을 사용한다. 사용 후에 이 용액은 정화한 후 버려야 한다.
12. 전기영동이 끝나면 전기를 끄고 도선을 제거한 후 gel tank의 뚜껑을 연 다음 gel을 자 외선 하에서 관찰하고 촬영한다.
※ PCR product purification
PCR product를 전기영동하면 product의 크기를 알 수 있으나 과연 원했던 sequence와 완전히 동일한가 아닌가는 알 수 없다.
이를 확실하게 증명하려면 DNA sequencing을 하여야 하는데 DNA sequencing을 하려면 우선 PCR한 DNA band를 정제 (purification)하여야 한다.
기본 개념은 PCR product를 직접 정제하거나 gel에서 DNA가 있는 부분을 오려낸 후 spin column을 사용하여 정제한다.
우선 날카로운 칼로 gel에서 PCR product가 있는 부분을 오려 작은 gel 조각을 얻는다. 이 gel 조각으로부터 DNA를 elution하는 여러 가지 kit가 있는데 kit의 원리는 우선 6 M NaI와 같은 물질로 gel을 녹이고 이 용액에 포함된 DNA를 어떤 물질에 결합시킨 후 washing하고 마지막에 우려내는 것이라고 할 수 있다.
B. Agarose gel에서 DNA의 용출
DNA를 전기영동하여 나타난 band 중에서 특정한 band를 gel로부터 유리해 내는 여러 방법 중 빠르고 간편하며 회수율과 순수도가 높아 kit를 많이 이용한다.
1) Gene Clean kit를 이용한 추출
Gene Clean kit에는 glassmilk라는 silica matrix가 들어 있다. Glassmilk는 쌍가닥 또는 외가닥 DNA에만 특이하게 결합하므로 DNA를 신속하게 분리할 수 있다. DNA 분리에 필요한 시간은 보통 15～20분 정도이며, DNA 회수율은 80% (크기가 500 염기 쌍 이하이면 효율은 더 낮아진다), 순수도는 cesium chloride를 이용하여 원심분리한 경우와 비슷하거나 더 좋은 편이다.
실험방법
1. 적어도 100 ng 정도 되는 DNA band를 날카로운 칼로 잘라내어 미세원침관으로 옮긴 다음 gel의 무게를 재고 3배 무게만큼 6 M NaI 용액을 첨가한다. 즉 200 ㎎의 gel 조각에 600 ㎕의 용액을 첨가한다.
2. 45～55°C에 10분 두어 gel을 완전히 녹인다. 2～3분마다 원침관을 흔들어 섞어준다.
3. Glassmilk를 5 ㎕ 첨가한 후 진탕하여 섞는다. Glassmilk는 무거워 가라앉아 있으므로 잘 섞어서 사용해야 한다.
* Glassmilk 1 ㎕는 1 ㎍ 정도의 DNA와 결합한다. DNA양이 소량인 경우에도 기본적으로 5 ㎕을 첨가하는 것이 좋으며 5 ㎍ 이상이 되면 추가되는 DNA 1 ㎍ 당 glassmilk 1 ㎕ 를 첨가한다.
4. 실온 또는 얼음에서 5분 두어 DNA와 glassmilk가 결합되게 한다. 조심스럽게 흔들어 주 어도 좋다.
5. 실온에서 최고속도로 15초 동안 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 상층액을 제거한 다.
6. 세척용액 (washing solution) 500～800 ㎕를 첨가한 후 진탕하여 잘 섞는다.
* 세척용액 (50% ethanol, 10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCl)은 상품 구입 시에 ethanol을 제외한 stock solution형태로 제공된다. 설명서를 참고하여 ethanol과 증류수로 만든 용액은 -20°C에 보관하였다가 필요한 경우에만 꺼내어 사용한다.
* 5 kb 이상인 DNA를 gene clean하는 경우에는 진탕하지 말고 pipetting으로 조심스럽게 부유하는 것이 좋다. 심하게 vortex하면 DNA가 부서질 위험이 있다.
7. 다시 위와 같이 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 상층액을 제거한다.
8. 위의 6, 7 과정을 2회 더 반복한다.
9. 상층액을 완전히 제거한 후 10～20 ㎕의 증류수 (또는 TE, pH 8.0)를 첨가하여 섞은 후, 45～55°C water bath에 5분간 둔다. 이 과정에서 glassmilk와 결합해 있던 DNA가 증류 수로 녹아 나온다.
10. 실온에서 15,000 rpm으로 30초 동안 원심분리하여 glassmilk를 가라앉힌 후 DNA가 녹 아 있는 상층액을 조심스럽게 새 미세원침관으로 옮긴다.
* 이 과정에서 한번 용출한 DNA는 처음 양에 비하여 약 80% 정도가 된다. 9, 10 과정을 한번 더 반복하면 거의 95% 이상의 회수율을 얻을 수 있다고 한다.
2) QIAquick kit를 이용한 추출
이 kit는 silica-gel membrane을 이용한 column에 DNA가 결합함을 이용한 것이다. 회수율과 순수도가 높고 아주 간편하여 많이 쓰고 있다.
실험방법
1. DNA band를 날카로운 칼로 잘라내어 미세원침관으로 옮긴 다음 gel의 무게를 재고 3배 무게만큼 QX1 용액을 첨가한다. 즉 200 ㎎의 gel 조각에 600 ㎕의 용액을 첨가한다.
* 2% 이상의 agarose gel인 경우 6배의 용액을 쓴다. 또 만약 gel 무게가 400 ㎎이 넘으면 여러 개로 나누어서 실험한다.
2. 50°C에 10분 두어 gel을 완전히 녹인다. 2～3분마다 원침관을 흔들어 섞어준다.
3. 처음 gel 무게만큼 isopropanol을 첨가하고 섞는다. (200 ㎎이면 200 ㎕)
4. QIAquick spin column을 collection tube에 설치하고 DNA 용액을 첨가한 다음 12,000 rpm에서 1분간 원심분리한다.
5. 밑으로 빠진 용액을 버리고 다시 위치시키고 0.5 ㎖의 QX1 용액을 첨가하고 다시 원심 분리한다.
6. 세척을 위해 0.75 ㎖의 PE 용액을 가하고 다시 원심분리한다. 여기에서 빠진 용액을 버 리고 그대로 다시 1분간 원심분리하여 완전히 용액을 제거한다. 이때, column 가장자리의 턱에 걸린 용액이 아주 소량 남으므로 이를 흡입기나 pipette을 이용하여 제거한다.
7. Column을 새 미세원침관에 설치하고 증류수나 TE, pH 8.0 50 ㎕를 중앙 membrane에 떨어뜨리고 1분간 최고속도로 원심분리 한다. 만약 30 ㎕를 쓰는 경우는 용액을 떨어뜨린 후 1분간 두었다가 원심분리 한다. 용출 된 부피는 약 2～3 ㎕ 줄어있게 된다.
2) 얻은 유전자를 vector에 삽입
(1) Vector
※ Vector의 기능
1. 세포 내에서 자가복제 (self-replication)를 한다
세균 세포 내 세균이 고유하게 가지고 있는 chromosomal DNA외에 세균에 존재하는 Plasmid는 한 세포 내에서도 스스로 복제하여 수많은 copy가 존재할 수 있다.
2. 항생제를 이용한 선택 (selection) 이 가능하다.
Vector에 존재하는 항생제 내성 유전자를 이용하면 DNA가 세포 내로 주입되었는지 아 닌지를 판별할 수 있는데 세포 속으로 DNA가 들어간 세포만을 선별하는 것을 selection 이라고 한다.
3. Multiple cloning site (MCS)를 이용할 수 있게 해 준다.
vector의 일정부위에 제한효소 절단부위가 밀집된 부분이 있어서 cloning을 용이하게 한 다.
4. Vector 부위를 이용한 DNA sequencing, 단백질 발현 등을 할 수 있게 해 준다.
원하는 유전자를 삽입한 뒤 Vector에 존재하는 염기서열을 이용한 DNA sequencing 을 하기도 편하고, vector에 달린 여러 부분을 이용하여 단백질 발현도 가능하다.
※ Vector의 종류
Vector의 종류에는 plasmid, bacteriophage, cosmid, phagemid 등이 있는데 그중 가장 널리 쓰이는 것이 plasmid이다. Plasmid는 self-replicatable, extrachromosomal, double stranded, small circular DNA다.
세균에는 자신이 꼭 가져야 할 chromosomal DNA 이외에 작고 동그란 DNA인 plasmid가 있기도 한데 이 DNA는 세포 내의 복제 장비를 이용해서 chromosomal DNA와는 상관 없 이 자가복제 (self-replication)할 수 있다. 그런데, plasmid는 한 세포 내에서도 많은 수를 가지고 있을 수 있어 한 세포 당 몇 개까지 가질 수 있는가를 plasmid의 copy number라 고 하고 이는 plasmid의 성질에 따라서 틀린데, 많게는 1,000개까지 된다고 한다.
Plasmid 하나에 특정 유전자를 끼워 넣고 세포에 넣어준다면 그 plasmid가 자가복제하는 동안 그 유전자는 증폭이 되는 것이다.
(2) Restriction enzyme
※ Recombinant DNA
유전자 재조합 기술이란 DNA를 자르고 붙여서 새로운 DNA를 만든다는 말로 자르는 일 은 restriction enzyme이, 붙이는 일은 DNA ligase가 한다.
※ 제한효소 (restriction enzyme)
DNA를 자른다는 것은 nucleotide들이 연결되어 있는 phosphodiester 결합을 끊어내는 것 으로 이런 역할을 하는 효소를 nuclease라고 하며 바깥쪽을 자르는 exonuclease와 안쪽을 자르는 endonuclease가 있다. 제한효소 (restriction enzyme, restriction endonuclease)는 endonuclease로 DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다.
제한효소의 3가지 type중 실험실에서 사용되는 것은 대부분 Type II restriction enzyme으 로 인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소로 4개, 5개, 또는 6개의 염기서열 을 인식한다. 제한효소의 명명은 발견된 세균의 이름 및 serotype에 따라서 붙이게 된다.
제한효소가 인식할 수 있는 부위는 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양 (palindrome)을 하고 있는 것이 특징이다. 잘린 후의 DNA 모양은 5'-overhang cohesive end, 3'-overhang cohesive end (sticky end) 또는 blunt end가 만들어질 수 있으므로 목적 에 따라서 잘 선택해서 사용해야 한다.
예1) EcoR I 효소의 절단 부위: 5'-overhang cohesive end 형성
5'--GAATTC--3' → 5'--G AATTC--3'
3'--CTTAAG--5' 3'--CTTAA G--5'
예2) Sac I 효소의 절단 부위: 3'-overhang cohesive end 형성
5'--GAGCTC--3' → 5'--GAGCT C--3'
3'--CTCGAG--5' 3'--C TCGAG--5'
예3) Sma I 효소의 절단 부위: blunt end 형성
5'--CCCGGG--3' → 5'--CCC GGG--3'
3'--GGGCCC--5' 3'--GGG CCC--5'
1) 제한효소를 이용한 DNA의 절단
제한효소 1 unit는 1 ㎍의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양으로 상품화된 효소는 대개 10 units/㎕ 내외의 농도로 공급된다.
제한효소 처리 반응은 절단하려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성되는데 다음과 같은 점들을 고려해야 한다.
(1) DNA의 순수도가 제한효소 처리 효율에 중요하다. DNA 용액 내에 단백질이 남아있는 경우는 많은 양의 효소가 필요하고 Phenol과 같은 유기용매가 남은 경우는 제한효소에 잘리지 않는 DNA가 남는 경우가 많다.
(2) Linear DNA의 끝 부분을 자를 경우, 효소에 따라서 인식서열에 몇 개의 염기가 더 붙 어 있어야만 잘리는 것들이 있다. 그러므로 plasmid vector의 multiple cloning site를 두 가지 효소로 자르는 경우와 PCR primer에 제한효소 인식부위를 넣어 design할 경우에 반드시 고려해야 한다.
(3) 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다.
(4) 제한효소마다의 최적온도, 반응완충용액 (reaction buffer)의 조성 및 불활성화 온도 등 에 알맞은 반응 조건에서 시행한다.
(5) 반응 조건이 최적이 아닌 경우에는 더 많은 양의 효소를 사용해야 한다. 이는 효소들의 최적 조건이 다른 두 가지 이상의 효소로 자르는 경우, 비 특이적으로 아무 곳이나 다 잘리는 star activity라 불리는 현상이 나타날 수도 있으므로 주의해야 한다.
(6) 효소가 인식부위를 자르는 데에 있어서 같은 인식부위라도 주위 염기서열에 따라 그 활 성도가 다를 수 있으므로 DNA 양으로 계산한 효소 양보다 조금 더 많이 넣어주는 것 이 좋다.
실험방법
1. 미세 원침관에 micropipette으로 다음과 같이 넣는다.
① 절단하고자 하는 DNA 5 ㎍
② 10x 반응완충용액 2 ㎕
③ 제한효소 (10 units/㎕) 1 ㎕
④ 증류수 up to 20 ㎕
* 이 때 효소를 가장 마지막에 넣는 것이 좋으며 효소 원액에는 glycerol이 들어있기 때문 에 점도가 높아서 pipetting할 때 tip 끝만 살짝 담궈서 덜어내어야 tip 주위에 효소가 많 이 묻어 나오는 것을 막을 수 있으며 효소량이 반응 총액의 10%를 넘으면 효소 활성이 glycerol에 의해 억제될 수 있기 때문에 주의해야 한다. 총 부피는 대개 20 ㎕로 한다.
* 효소는 -20°C에서 50% glycerol이 들어있는 완충액 내에서 안정하게 존재하므로 반드시 냉동실에 보관하고 실온에 노출되는 시간을 가능한 한 줄인다.
2. 기포가 생기지 않게 주의하면서 섞는다. 섞는 방법은 손가락 끝으로 가볍게 툭툭 치는 방법 (tapping), pipette을 up-down하는 방법, 살짝 vortex하는 방법 등이 주로 쓰인다.
3. 약 3～5초간 원침 (brief centrifuge)하여 반응할 재료들이 바닥에 모이도록 한다.
4. 37°C (효소에 따라서 다를 수 있음)에서 1～2 시간 반응시켜 DNA가 충분히 절되도록 한다.
5. 반응액에 전기영동 완충용액을 첨가하여 agarose gel 전기영동을 시행한다. 또는 혼합액 을 불활성화 시키기 위하여 65°C로 20분 동안 가열하거나 0.5 M EDTA (pH 8.0)을 최 종농도 10～50 mM 되도록 첨가한다.
* 불활성화 온도는 효소마다 조금씩 다르므로 (65～85°C) 제조회사의 안내서를 참고한다. EDTA 용액을 이용하는 방법은 자른 DNA를 사용하여 곧바로 다른 반응을 해야 할 경 우에는 반응을 억제할 수 있으므로 피하여야 한다. 다른 반응으로 들어가는 경우는 반응 액 내에 있는 단백질(효소) 및 salt의 제거를 위해서 phenol / chloroform 추출을 한 후 ethanol로 침전시키는 방법도 있지만 DNA 양이 적을 때는 손실의 우려가 있다. 최근에 는 여러 회사에서 판매되는 DNA purification kit 들이 있으므로 이를 사용하는 것도 좋 다. DNA를 바로 전기영동할 때는 불활성화 시킬 필요가 없다.
※ DNA sample이 잘 잘리지 않은 경우 다음과 같은 사항을 check해 본다.
(1) 효소가 inactive하다. (효소가 오래됐거나 보관 상태가 불량한 경우가 많다. 이 경우는 test DNA를 함께 잘라 봄으로써 검사한다.)
(2) DNA가 순수하지 못하다. (Salt, polyethylene glycol, protein, EDTA, phenol, SDS, residual ethanol 등이 남은 경우 흔히 발생한다. 이 경우는 phenol / chloroform 추출 -ethanol 침전- 70% ethanol wash를 다시 시행하여 제한효소 처리함으로써 좋은 결과 를 볼 수 있다. 반응액에 2 mM spermidine을 첨가해 주면 더 효과적일 수 있다.)
(3) DNA가 완전히 용해되어 있지 않거나 너무 점성이 크거나 또는 너무 진하다. (이런 경 우는 커다란 genomic DNA에서 잘 발생된다. 잘 녹이고 더 묽게 하여 자른다.)
(4) DNA가 denaturation 되어있다. (적당한 salt나 MgCl2같은 것이 없는 상태에서 60～ 70°C이면 denaturation될 수 있다. 자르지 않은 undigested DNA를 함께 전기영동하여 비교해 보면 된다.)
(5) DNA가 degradation되어 있다. (이 경우도 undigested DNA를 함께 전기 영동 해 본다. 때로는 undigested DNA는 degradation되어있지 않은데도 제한효소로 자르면 DNA가 조각나는 경우를 경험할 수 있다. 이 때는 제한효소의 star activity를 의심하기도 하 고 제한효소가 너무 많은 경우 또는 완충용액이 맞지 않는 경우도 있지만 시약들 중 일부가 오염되어있는 경우가 많으므로 시약들을 바꾸어 실험해 보는 것이 좋다.)
2) 두 가지 제한효소를 이용한 DNA의 절단
두 가지 제한효소를 사용하는 경우 유의사항
(1) 제한효소로 잘리는 부위가 너무 가깝지나 않은지 상세히 실험 design을 검토해 본다.
(2) 두 제한효소의 반응조건을 검토해본다.
두 가지 제한 효소의 절단은 One-phor-all buffer를 사용하는 것이 가장 쉽고 빠른 방 법이다. One-phor-all buffer (Pharmacia)란 대부분의 제한효소에 적당하도록 그 조성을 결정하여 만든 buffer이며, 제한효소에 따라서 최종으로 10배 또는 5배 (드물게 20배도 있음) 희석하여 사용할 수 있다. 그러므로 수많은 효소 중에서 10배 희석하여 쓰는 group의 제한효소들끼리, 5배 희석 효소들끼리는 쉽게 최적 조건이 맞추어질 수 있다.
(3) 두 제한효소의 고유 조건이 같으면 고유 buffer를 쓴다.
(4) 두 효소의 buffer가 다르면 One-phor-all buffer의 조건을 맞추어 본다.
(5) 위의 사항에 모두 맞지 않는 경우는 어쩔 수 없이 하나씩 처리해야 한다. 이런 경우는 다음과 같은 방법이 있다. 먼저 낮은 salt 농도에서 활성이 있는 효소로 먼저 자른 후 다음에 처리할 효소 반응액의 salt 농도에 맞게 1 M NaCl을 소량 첨가하여 조정한다. 혹은, 한 가지 효소로 자른 후에 phenol-chloroform 추출을 시행한 후 침전하고 다음 효소를 반응시킨다.
(6) 시약 회사에서 추천하는 완충용액의 종류가 다른 경우에는 활성이 약한 완충용액을 사 용하는 경우 효소의 양을 증가시켜 사용해도 무방하다.
(7) 두 가지 효소를 사용하는 경우에도 효소량이 반응 총액의 10%를 넘지 않도록 한다.
(8) 최적온도가 다른 두 가지 효소를 처리하는 경우 반응액의 조성은 그대로 두고 온도를 번갈아 처리해도 되지만 이 경우에도 따로따로 처리하는 것이 바람직하다.
실험방법
1. 미세 원침관에 micropipette으로 다음과 같이 넣는다.
① 절단하고자 하는 DNA 5 ㎍
② 10x One-phor-all buffer 4 ㎕
③ 제한효소 1 (10 units/㎕) 0.5 ㎕
④ 제한효소 2 (10 units/㎕) 0.5 ㎕
⑤ 증류수 up to 20 ㎕
* 위에서는 두 가지 효소가 모두 One-phor-all buffer가 최종 2x 일 때 최적 조건이 되는 경우이다. 효소량을 높이고 싶은 경우 총 반응 부피를 늘리는 것이 좋다.
2. 한 가지 제한효소를 처리할 때와 같이 실험을 진행한다.
같은 효소로 잘라진 부위는 같은 끝을 가지고 있으므로 결합시키면 새로운 재조합 DNA (recombinant DNA)가 만들어진다
(3) DNA ligation과 T-vector를 이용한 PCR product의 cloning
PCR에서 사용한 Taq DNA polymerase를 비롯해서 DNA polymerase는 DNA를 5'에서 3' 방향으로 합성하므로 template가 끝나는 부분에서 합성이 끝나 blunt end인 PCR product가 형성될 것을 예상하지만 실제로 PCR product의 모습은 다른 blunt end DNA와는 다른 다음과 같은 특징이 있다.
(1) Primer의 5'쪽에는 phosphate가 없다
DNA의 5'에는 phosphate가 있으나 PCR 반응 산물의 5' 끝은 우리가 넣어준 primer로 이 primer의 5' 끝은 phosphate가 없다. Primer를 만드는 in vitro DNA synthesizer로 DNA를 합성하는 과정은 생체 내에서와는 달리 3'쪽에서 5' 쪽으로 되는데, 이 과정에서 5'의 phosphate가 붙을 수 없기 때문이다.
(2) Taq DNA polymerase는 합성이 끝난 후 3' 끝에 A를 하나 더 붙인다.
이것은 Taq DNA polymerase의 고유한 성질로, template가 없음에도 불구하고 A를 하나 더 붙이고 끝나는데 이렇게 template 없이 3' 쪽에 nucleotide를 달아 가는 효소를 terminal deoxynucleotidyl transferase라고 한다. 그러므로 DNA ligation을 하기 위해서 T로 끝나는 vector를 쓰는 것이고 그것이 바로 T-vector이다.
※ T-vector
T-vector는 PCR product의 cloning에 너무도 많이 이용되기 때문에 여러 회사에서 T-vector를 만들어 상품으로 나와 있으나 100% T-vector가 되는 것은 아니고 일부 blunt로 남아있을 수도 있으며 또한 시간이 지나면 조금씩 T가 떨어질 수도 있다.
Ligation은 문자 그대로 DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정으로 이 반응에 이용되는 효소를 ligase라하며 DNA를 기질로 사용하는 ligase를 DNA ligase, RNA를 기질로 사용하는 ligase를 RNA ligase라 한다.
유전자 재조합 과정에 사용되는 ligase는 주로 DNA ligase이며 이 효소는 원핵세포, 진핵세포, 바이러스 등에서 유래한 것이 있는데, 현재 많이 사용되는 ligase는 T4 DNA ligase와 E. coli DNA ligase이다. T4 DNA ligase는 cofactor로 ATP를 필요로 하고, E. coli ligase는 NAD+를 필요로 한다. 이들 두 ligase는 blunt-ended DNA, cohesive-ended DNA, nicked DNA등에 모두 작용할 수 있으나 E. coli DNA ligase 는 T4 DNA ligase와 비교할 때 blunt-ended DNA에 작용하는 힘이 약하므로 일반적인 유전자 재조합 과정에서는 T4 DNA ligase를 더 많이 사용하는 경향이 있다.
DNA ligation-phosphodiester bond
A. Cohesive end ligation
실험방법
1. 실험에 사용할 vector와 insert를 준비한다. 물론 vector와 insert는 끝이 같은 모양을 하고 있어야 한다. 즉 같은 제한효소에 의해 절단되어 같은 조각을 이루고 있어야 한다.
* 일반적으로 vector의 크기 1 kb당 50～100 ng의 양이면 vector의 양은 충분하며 insert는 크기에 따라 vector와 몰 비를 고려하여 혼합한다. 몰 비는 실험자에 따라서 1:1 (equimolar)에서 1:4 까지도 쓰며 특수한 경우에는 insert를 더 많이 넣기도 한다.
* Ligation된 DNA는 형질전환에 그대로 이용하는 경우가 대부분이다. 그런데 한번의 형질 전환에 이용되는 DNA의 부피는 대개 10 ㎕이므로 ligation의 최종부피가 너무 많으면 좋 지 않다. 대개는 10～30 ㎕ 정도로 한다.
3. 10x ligation buffer (전체부피의 1/10)와 T4 DNA ligase (1 ㎕)를 혼합하고 잘 섞는다.
* 10x ligation 완충용액의 조성은 시약회사마다 조금씩 다르긴 하지만 대개의 경우 500 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 200 mM DTT (dithiothreitol), 10 mM ATP이다.
* 제조회사에서 나오는 T4 DNA ligase는 unit 수가 다르게 표시되어 있는 경우가 많다. Cohesive end ligation unit 1 unit는 0.015 Weiss unit에 해당한다. 예를 들어 Poskochem enzyme은 100 cohesive end ligation unit/㎕이고 Amersham enzyme은 2.5 Weiss unit/㎕ 로 되어 있는데, 대개는 모두 반응 당 1 ㎕를 쓴다. 또한 enzyme에 딸려오는 buffer에는 대개 ATP가 들어있으므로 반드시 설명서를 잘 읽고 써야 한다. One-phor-all buffer를 쓸 수도 있는데, 이때는 ATP를 따로 넣어주어야 한다.
* ATP는 cohesive end ligation인 경우 최종 1 mM, blunt end인 경우 최종 0.5 mM로 하 는 것이 최적 반응조건이지만 대개는 모두 1 mM로 쓴다.
4. 적당한 온도 (보통 16°C 또는 22°C)에서 4시간 이상 반응시킨다.
5. Ligation 반응이 끝나면 4°C에 보관하였다가 박테리아의 형질전환에 이용한다.
* 형질전환 시에는 competent cell이 200 ㎕로 분주 되어 있으므로 위의 ligation 혼합액 중 8～10 ㎕만 써서 형질전환하고 나머지는 보관한다.
B. Blunt end ligation
실험방법
근본적으로 cohesive end ligation과 같은 원리이지만 blunt end인 경우 cohesive end인 경우보다 효율이 낮으므로 (1/10에서 1/100 정도) T4 DNA ligase의 양을 더 많이 사용하거나 vector, insert의 양을 더 많이 사용하는 것이 좋다. ATP의 농도는 0.5 mM일 때가 최적으로 알려져 있으며 ATP의 농도가 높으면 반응이 억제될 수 있지만. 대부분의 회사에서 나오는 10x ligation buffer에 ATP가 10 mM로 들어있기 때문에 cohesive end와 마찬가지로 최종 1 mM로 쓸 때가 많다. One-phor-all buffer를 써서 다음과 같이 조성을 정하는 것도 좋다. 효소는 1 ㎕만 넣어도 blunt end ligation에 충분한 양이고, 너무 많은 양을 넣으면 glycerol 때문에 오히려 활성이 떨어질 우려가 있다.
① DNA mix (insert and vector) 20 ㎕
② 10x One-phor-all buffer 3 ㎕
③ 10 mM ATP 1.5 ㎕
④ Sterile water 4.5 ㎕
⑤ T4 DNA ligase 1.0 ㎕
(전체부피 30 ㎕)
3) 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입
(1) Transformation
Transformation (형질전환)이란 DNA를 bacteria 세포 내로 주입하는 과정으로 Prokaryote와 eukaryote에서는 DNA를 세포 내로 주입할 때 다음과 같이 조금 다른 용어를 사용는데 이 실험에서는 prokaryote인 E.coli를 사용하므로 transformation이라 한다.
Cell DNA Term
Prokaryote Plasmid Transformation
Bacteriophage (virus) Infection
Eukaryote Plasmid Transfection
Virus vector Transfection
※ Competent cell
Competent cell이란 정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미한다. 화학처리에 쓰이는 시약에는 Calcium Chloride, Manganase Chloride, Hexamminecobalt Chloride, Dimethyl Sulfoxide (DMSO)가 있다.
Competent cell을 이용한 transformation의 과정은 CaCl2로 처리하여 competent cell로 만들면 plasmid가 cell에 들어갈 수 있게 되고 Heat shock을 가해 plasmid가 cell 안으로 들어가는 효율을 증가시킨다.
A. 배지 만들기
1) 배지조성
(1) LB 배지 (Luria-Bertani medium) 1 liter
bacto-tryptone 10 g
bacto-yeast extract 5 g
NaCl 10 g
* 실험실에서 가장 흔히 사용되는 배지로 위 성분을 950 ㎖의 증류수에 녹인 후 pH 7로 맞 추기 위해 5 N NaOH를 첨가 (약 200 ㎕)하고 증류수로 1 liter 채운 다음 autoclave한다.
(2) SOB 배지1 liter
bacto-tryptone 20 g
bacto-yeast extract 5 g
NaCl 0.5 g
* Competent cell 제조 시에 사용하는 배지이다. 950 ㎖의 증류수에 녹인 후 250 mM KCl 10 ㎖를 첨가하고 5 N NaOH를 이용하여 pH를 7로 맞춘 다음 증류수로 1 liter까지 채 우고 autoclave한다. 사용하기 직전에 멸균한 2 M MgCl2를 최종농도 20 mM이 되도록 첨가하여 사용한다.
(3) SOC 배지 (Terrific Broth)
* 20 mM의 MgCl2가 함유된 SOB 배지에 20 mM glucose가 첨가된 배지이다. 1 M glucose 용액은 100 ㎖에 18 g의 glucose를 녹여 0.22 ㎛-pore의 filter를 통과시켜 사용 한다. 박테리아의 형질전환 시에 사용한다.
2) 위의 배지는 액체로 사용하기도 하는데, 이를 이용한 plate를 만드는 경우 autoclave를 하기 전에 최종농도 1.5%가 되도록 agar powder (15 g/liter)를 첨가한다.
3) 15 lb/sq로 20분 이상 autoclave한다.
4) 배지가 적당히 (65°C 정도) 식을 때까지 기다린 후 필요하면 ampicillin을 60 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고 잘 흔들어 섞는다.
* Ampicillin은 가루를 증류수에 녹여 50～100 ㎎/㎖의 농도로 만들고 filter 후 1 ㎖ 씩 분 주하여 -20°C에 보관한다.
5) 배지를 petridish에 조심스럽게 붓고 기포가 생기면 달구어진 loop를 이용하여 제거한다. 하루정도 상온에 놓아둔 후 wrap으로 잘 싸서 4°C에 뒤집어서 보관한다.
* 배지의 온도가 너무 높으면 ampicillin의 활성이 떨어지고, 배지가 너무 식으면 plate를 제 조하는 도중 배지가 굳을 가능성이 있으므로 적당한 온도에서 작업할 수 있도록 한다.
B. Calcium chloride를 이용한 competent cell 만들기
이 방법은 Cohen등에 의해 개발된 방법을 약간 변형시킨 것으로 대략 107 transformed colonies/㎍ of supercoiled DNA의 효율을 가지며 간편하여 실험실에서 많이 사용되는 방법이다. 이 방법으로 만든 competent cell은 시간이 오래 지날수록 형질전환 효율이 다소 감소하긴 하지만 -70°C deep freezer에 보관하여 사용할 수 있다.
실험방법
1) 일주일이내 LB plate에 배양된 E. coli (DH5α, XL-1 Blue, XL-2 Blue, Top 10, JM 109, etc) single colony를 LB broth 2 ㎖에 접종한 후 밤새 (o/n) 키운다.
2) 위에서 키운 배양액 1 ㎖을 100 ㎖ LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600이 0.38이 될 때까지 37°C shaking incubator에서 키운다.
* O.D.600이 0.4이상 배양된 경우 transformation efficiency가 매우 낮다.
3) 배양액을 50 ㎖ conical tube에 40 ㎖ 넣고 얼음에 10분간 놓아둔다.
4) 4°C에서 5,000 rpm으로 5분간 원심분리 한다.
5) 상층액을 완전히 제거한 후 cell pellet을 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl2 용액을 원래의 1/2부피로 (20 ㎖) 넣고 현탁 시킨다.
6) 얼음에 30분 놓아두었다가 다시 4°C에서 4,000 rpm으로 5분간 원심분리 한다.
7) 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피 (4 ㎖)의 filtered CaCl2 용액 + 20% (v/v) glycerol 로 현탁 시킨다.
8) 미리 차게 해둔 microfuge tube에 100 ㎕ 씩 분주하고, 사용 할 때까지 deep freezer에 보관한다.
C. 박테리아의 형질전환
박테리아의 형질전환이란 plasmid DNA를 세포 내로 넣어주는 작업을 말한다. 형질전환은 가능한 한 효율적인 방법을 찾는 것이 중요한데 Large DNA는 small DNA보다 형질전환 효율이 떨어지며 DNA의 양이 너무 많아도 좋지 않으므로 적당한 길이와 적당한 양의 DNA를 사용하는 것이 중요한 요소이다.
실험방법
1. -70°C deep freezer에 100 ㎕ 씩 보관된 competent cell tube 하나를 꺼내어 손바닥에 쥐고 있으면 cell 용액이 녹기 시작한다. Cell 용액이 다 녹으면 곧바로 얼음에 넣어둔다.
2. 10 ㎕ 이하의 DNA를 100 ㎕ competent cell에 넣고 tube를 4～5번 기울이거나 가볍게 손끝으로 쳐서 부드럽게 섞는다.
* DNA 용액은 competent cell 부피의 5%를 넘지 않는 것이 좋다. DNA의 양이 많다고 효 율이 점점 증가하지는 않는다.
3. 얼음에 30분 동안 둔다.
4. 42°C 에서 90초간 heat shock을 준다.
5. 얼음에 2～3분 두었다가 LB 또는 SOC 배지 (SOB 배지에 20 mM glucose 함유) 800㎕를 넣고 잘 섞은 후, 37°C 에서 45분간 진탕배양 한다.
6. 미리 37°C에 두었던 LB (with ampicillin) plate에 위 혼합액을 적당량 pipette으로 떨어뜨린 후, spreader로 골고루 펴준다.
※ LacZ 유전자를 이용한 color selection을 하는 경우, 배지에 isopropylthio-β -D-galactoside (IPTG)와 X-gal을 첨가해주어야 한다. X-gal (50 ㎎/㎖) 20～40 ㎕와 IPTG (839 mM) 5～10 ㎕를 미세원침관에서 섞어 배지 위에 떨어뜨리고 밀대로 골고 루 펴주면 되는데, 37°C에 적어도 10분 두었다가 박테리아를 도말 하도록 한다. X-gal 은 50㎎/㎖의 농도로 dimethylformamide (DMF)에 녹여 빛이 차단된 용기에 담아 -20°C에 보관하고, IPTG는 2 g을 증류수에 녹여 10 ㎖ 까지 채운다음 0.22 ㎛-filter하 여 1 ㎖씩 나누어 -20°C에 보관한다.
7. 37°C 배양기에서 plate를 뒤집어서 밤새 배양한다. 12～16시간이면 colony를 관찰할 수 있다.
(2) 항생제와 LacZ를 이용한 Selection
※ Plasmid의 구성
Plasmid는 크게 다음과 같은 세 부분으로 구성되어 있다.
(1) Replication origin
이 부분은 plasmid가 자가복제할 때 처음 인식하는 부위로 모든 plasmid에 꼭 필요한 부분으로 ColE1 ori 라고 씌여진 부분이다.
(2) Antibiotics resistance gene
이것은 항생제에 내성을 나타내는 유전자로 대개는 ampicillin resistance gene이 들어 있는데, 이 경우 여기서 나오는 단백질은 beta-lactamase이며 AmpR이라 쓴다.
(3) Multiple cloning site(MCS)와 LacZ'
이 부위는 제한효소로 잘릴 수 있는 부위를 한꺼번에 모아놓은 부분으로 다른 부분은 절대 잘리지 않고 이 부분에만 잘릴 수 있도록 열 몇 가지 제한효소 절단부위를 인위적으로 조작해 놓았다. 이 MCS 부위는 길어야 100～150 bp 정도이며 앞 뒤 부분에 SP6, T3, T7 promoter 등이 붙어있다. 이런 부위는 RNA를 시험관에서 만들거나 단백질 발현을 시킬 때, 그리고 DNA sequencing 같은 실험을 할 때 쓰이는 부위이다.
※ 항생제를 이용한 selection
Transformation한 후의 결과는 다음 세 가지 중의 하나로
(1) Plasmid가 들어가지 않은 경우
(2) Plasmid가 들어갔으나 plasmid에 원하는 gene이 들어가지 않은 경우
(3) 원하는 gene이 포함된 plasmid가 들어간 경우
Plasmid에는 antibiotics resistance gene이 포함되어 있으므로 항생제가 포함된 배양접시에서 자란 colony는 모두 plasmid가 들어가 있는 cell이다. 그러나 재조합되지 않은 plasmid가 cell 내에 들어가 있을 수도 있기 때문에 재조합 plasmid에 원하는 gene이 제대로 들어가 있는지 확인할 필요가 있는데 이 방법이 LacZ를 이용한 color selection 이다.
※ LacZ를 이용한 color selection
LacZ를 이해하기 위해서는 Lac operon이란 것을 알아야 하는데 이는 박테리아에서 시행되는 유전자 발현 조절 기구로 E. coli가 lactose를 galactose와 glucose로 분해하는데 필요한 효소인 beta-galactosidase를 만드는 유전자로 Lactose가 없을 때에는 불필요한 유전자인 beta-galactosidase는 생성되지 않는다. 그 이유는 유전자의 앞쪽에 있는 inhibitor region에서 생성된 inhibitor가 promotor 영역의 operator 부분에 결합하여 RNA polymerase 가 활동하는 것을 방해하여 beta-galactosidase가 생성되지 않도록 하기 때문이다. 그러나 lactose가 배지에 있으면 이 물질이 inhibitor와 결합하여 operator에서 떼어내어 RNA polymerase가 잘 작용하므로 mRNA를 만들고, beta-galatosidase를 만들면서 lactose를 분해한다. 그 후 lactose가 다 분해되면 inhibitor가 다시 붙어 유전자는 turn off 된다.
이런 유전자 조절 기구를 실험에 이용하고자 하는 것이 바로 LacZ로 이 부분을 plasmid에 삽입해 놓게 되는데, 이때 LacZ operon이 동작하고 있는 가 확인하기 위해서는 IPTG와 X-Gal이라는 두 가지 물질을 사용한다. IPTG는 LacZ gene inducer역할을 해 Lactose 대신 inhibitor와 결합하지만 분해되지 않는다. X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galacto pyranoside)은 lactose 대신 beta-galactosidase에 의하여 대사 되는, 일종의 변형된 galactose sugar로서 원래 무색이지만 beta-galactosidase에 의하여 대사 되면 푸른색을 낸다. 따라서 LacZ의 MCS에 DNA가 재조합 되지 않은 박테리아의 colony는 LacZ가 제 기능을 발휘하여 X-Gal을 대사 시키므로 푸른색이 되고, DNA가 재조합 된 아 짤리네... 한글파일로 대체 ㅡ,.ㅡ;
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