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2004-03-29 00:59:32 | Hit : 13869 | Vote : 1309

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PCR(Polymerase Chain Reaction)의 설명과 그 응용

DNA의 열에 대한 특성과 고열에 내성을 가진 DNA polymerase를 응용하여 DNA의 특정부분을 필요한 양만큼 복제하는 기술로 수백 ~ 3kb의 길이를 복제할 때 주로 사용한다.
원리는 상보적인 두 가닥의 DNA를 열을 가하여 서로 분리(denaturation) 시킨 후 필요한 부분의 양 끝에 미리 제작한 약 20 base 길이를 가진 짧은 외가닥 DNA를 붙인 후 DNA polymerase의 일종인 Taq polymerase 또는 Tfl polymerase를 사용하여 dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP)를 재료로 새 DNA가닥을 복제하는 방식이다. 이론적으로 만약 30회 과정을 반복했을 때 주형(template)으로 사용한 DNA가닥수의 230가닥의 새로운 DNA가 만들어진다.

☞ 기본적 용어의 설명
- Primer set
Primer set은 forward/reverse primer라고도 부르는데 이는 DNA의 방향성과 관련이 있는 용어이다. 자세한 내용은 다음에 언급하기로 하고 일단 primer set은 원하는 target region의 상보적 strand의 각 5’부위의 끝에 있는 수십 base pairs 정도의 sequences대로 인위적으로 합성한 oligonucleotides라고 이해하면 된다. 중요한 point는 상보적이라는 것과 3' end 에서 부터 Taq polymerase가 작용해 새로운 strand를 합성해 나가기 시작한다는 것이다.

- dNTPs　　　　　　　　　　　　　　
dNTPs는 nucleic aicds (DNA,RNA)를 구성하는 LEGO block 같은 것으로 이해하면 된다. 중요한 것은 hydrogen bond가 3개인 GC 결합이 2개인 AT 결합보다 안정적이라는 것과 dNTPs는 단순한 building block의 역할을 하는 것 뿐만이 아니라 polymerase가 nucleic acids를 합성해 나가는데 필요한 energy를 제공하는 역할도 한다는 것이다.　

- Taq polymerase　　　　　　　　　　　　　　
Taq polymerase는 일반적으로 thermostable 혹은 heat-stable polymerase를 의미하나 원래는 그 기원이 Thermus aquaticus 라는 미생물에서 유래한 polymerase를 지칭하는 용어이다. 이 enzyme은 5’-> 3’ polymerization-dependent exonuclease activity를 가지고 있고 60bps/sec이 속도로 DNA를 합성해 나간다.

준비
DNA for template, dNTP, 25mlM MgCl, Primer 1, Primer 2, ddH₂O, PCR buffer, Taq polymerase or Tfl polymerase, PCR tube, Thermo
cycler, mineral oil(heating cover를 가진 thermo cycler에는 불필요)

실험방법
1. PCR 하려는 sample의 수 만큼 PCR tube를 준비하고 tube 번호를 쓴다.
2. Template DNA의 농도가 서로 같을 경우는 dNTP, 25mM MgCl, Primer 1, Primer 2, ddH₂O, PCR buffer, Polymerase를 PCR 하려는 tube의 수로 계산하여 한꺼번에 섞은 후 (pre-mix 제작) 각 tube에 똑같이 나누어 넣고 Template DNA를 각각의 tube에 넣는다.
3. Template DNA의 농도가 각각 다를 경우는 위에서 ddH₂O를 제외한 나머지를 PCR하려는 tue의 수로 계산하여 한꺼번에 섞은 후 각 tube에 똑같이 나누어 넣고 Template DNA를 각각의 tube에 넣는다.
4. Thermo cucler는 기본적으로 아래와 같다.
① 93°C ~ 95°C의 pre-denaturation
② 93°C ~ 95°C의 denaturation
③ 45°C ~ 60°C의 anealing
④ 72°C ~ 74°C의 extension
⑤ 72°C ~ 74°C의 final extension
⑥ 4°C의 store
∴ ① ~ ⑥의 단계로 set up하며 ②~ ④단계를 30~40회 반복하게 된다.

♣ 설명
1. Pre-denaturation
93°C ~ 95°C로 보통 약 5분간 가열하는 과정으로 DNA는 이 정도의 열에서 일정속도로 외가닥으로 분리가 된다. 2번과정보다 시간이 긴 이유는 원본template의 길이가 새로이 생성되는 DNA의 길이에 비해 훨씬 길기 때문이며, 다음 단계부터는 새로이 만들어진 상대적으로 원본보다 훨씬 짧은 DNA들이 template으로 사용되게 된다.

2. Denaturation
보통 93°C ~ 95°C로 30초에서 40초 정도이며, 쌍가닥 DNA가 외가닥으로 분리된다.

3. Anealing
일반적으로 45°C ~ 60°C에서 30 ~ 50초 정도 반응시키나, primer의 염기서열, 길이, melting point(TM)에 따라 조정해야 한다. 보통 primer의 TM보다 5°C정도 아래에서 시작하며 온도를 낮출수록 결합성이 강해지나, 차이가 있는 비슷한 염기서열에 잘못 결합한 가능성도 아울러 커진다.

4. Extension
72°C ~ 74°C정도에서 30 ~ 60초간 반응시킨다. DNA polymerase의 DNA 합성속도가 초당 수십 ~ 수백 base에 이르므로 너무 긴 시간은 불필요하다.

5. Final extension
4번과정에서 합성이 덜 일어난 DNA가닥들의 합성을 마무리하는 단계이다.

6. Store
모든 과정이 끝나고 합성된 DNA를 안정적으로 보존하는 단계로 필요할 때 끝내면 된다.

※ 주의사항
1. PCR에 필요한 chemical이나 효소 등은 시약을 제작하는 회사에서 kit로 판매하고 있으므로 최적의 조성을 동봉한다. 따라서 혼합비율은 구입한 회사의 제시를 참조한다.
2. DNA의 PCR kit의 구성물, 특히 polymerase는 실온에 방치하면 변성되기 싶다. 그러므로 항상 냉동상태(-20°C)로 보관하고 ice에 꽂아서 운반하고 실험해야 한다.
3. 모든 구성요소를 넣었다라고 잘 섞이지 않으면 PCR반응이 잘 일어나지 않는다. pipette으로 pumping하거나 손가락으로 tube를 툭툭쳐서 섞은 후 spin down한다.
4. 모든 구성요소들은 사용하기 전 냉동상태로 있다. ddH₂O를 제외한 모든 다른 구성요소는 완전히 녹인 후 균일한 농도로 만들어 사용해야 한다.