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오영민	2002-12-25 20:03:11 \| Hit : 16768 \| Vote : 18467

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chap.4 Characterisation of cell lines

한번 셀라인(cell line)이 확립(estalblished)되면, 그것은 특성화(characterised)된다.
그것은 종(species)의 확립(confirm)과 조직(tissue)의 본성(origin)때문이다.
--> fibroblast가 배지(culture)에서 잘 자라 다른 세포 종류(cell type)을 오염화(contaminate)하는 문제처럼 상호 오염화여부(no cross-contamination)의 확인(check)이 필요하다.
* 셀라인(cell line)은 주기적으로 상호 오염화 여부(no cross-contamination)과 불안정성(instability), 다른 셀특성으로 분화하는 성질(variation)에 대해 확인(check) 해야 한다.

4.2. 종의 다양성(Species varification)
4.2.1 Cytogenetics : heredity(유전성)와 variation(분화성)과의 chromosomal structure(염색체 구조)의 correlation(상호연관성).
* species의 most characteristic trait(특징적 특성)는 그것의 chromsome content(염색체 구성요소)이다.
* chromosomal analysis(염색체 분석)는 species(종) 사이의 most reliable distinguish method(가장 신뢰할 만한 구분적 방법)이다.
* karyotype : chromosomal number(염색체 번호), size(크기), shape(모양)에 쓰이는 term(용어)

# karyotype techniques : chromosome(염색체)의 size와 shape는 nuclear division stage(핵 분열 단계)에서 다양하다.
a. cell in mid-lag phase
b. incubated(배양) with colcemid or vinblastine (meta phase에 cell을 arrest(잡음))
c. cell division(분열) inhibited(억제) at metaphase
d. trypsinise (anchorage-dependent animal cell (부착성 동물 세포)을 배양용기 바닥에서 떼어냄)
e. cell suspension
f. incubate in hypotonic(KCl) solution (저장액에서 배양)
g. swollen cell (세포를 터뜨림)
h. incubate with methanol : acetic acid (3:1 v/v) at 4˚C to fix cells
i. fixed cell (세포를 고정)
j. centrifuge (원심분리)
k. cells collected and fropped onto a slide (세포를 모으고 슬라이드에 떨어뜨림)
l. dry (air or heat dried)
m. cells attached to slide (슬라이드에 세포를 부착시킴)
n. immerse in stain under appropriate conditions (적당한 환경에서 염색)
o. slide viewed and photographed (슬라이드에 놓고 사진촬영)

# Giemsa dye (=G-banding) pH 6.8에서 staining(염색)
chromosome(염색체) stain(염색)되어 bright나 dull fluorescent band(흐릿한 형광띠)나타내어 chromosome(염색체)분석에 쓰이는 reagent이다.

# Q-banding (Quinacrine banding)
interband region을 stain하는 quinacrine mustard나 quinacrine dihydrochloride를 사용하는 방법
human(인간)에서 Y chromosome(Y 염색체)하게 형광하여 G-banding에서 Y chromosome을 dull uniform하는 것과 다르므로 particular value(특별한 지시점)가 있다.

# C-banding
centromore region을 stain하여 G-banding에서 불분명한 지역을 clarify(확실하게) 한다.

# G11-banding
pH 11에서 Giemsa staning 하는 방법
* mouse chromosome의 pale blue centromere를 dark margenta(심홍색)로 stain(염색) 한다.
* human chromosome의 chromosome number(1,4,5,7,10,13,14,15,20,21,22)의 red region에 blue로 stain 한다.
--> mouse/human hybrid, 즉, hybridomas를 측정하는 value(측정치)를 제공한다.

4.2.2. Isoenzymology
animal tissue(동물조직)에서 어떤 enzyme은 multiple form(다양한 구조)으로 존재한다.

# Isoenzyme(=isozyme)
같은 reaction(반응)을 catalysis(촉매)하는 enzyme의 different molecular form(다른 분자적 구조)
chromatography나 electrophoresis(전기영동)를 통해 isoenzyme을 seperate(분리) 할 수 있다.
--> enzyme band의 수나 intensity는 species의 indicative이고 cell line의 lineage 이다.
확립한 band를 다른 species의 conventional band pattern을 보여주는 publication(이미 나와있는 자료)과 비교한다.
ex) Esterase enzyme의 비교
{human kidney},{HeLa,human skin, Human heart}, {L5178Y(mouse)}의 gel band의 비교
agarose cassette system에 의한 다른 isoenzyme의 mobilities(움직임)의 determination(결정)은 cell line의 identity(구분점)를 establish(결정짓는)하는 효과적 방법이다.
--> 비교적 정확하고 빠르며 less expensive(값이 비싸지 않다)하다.

# glucose 6-phophatate dehydrogenase(G6PDH)
* A형 - caucasian(백색인종), 80% negroids(흑인)
* B형 - 20% negroids, HeLa(자궁암에서 확립된 세포주)

# Lactose dehydrogenase(LDH)
# nucleoside phophorylase(NP)
# esterase

4.2.3. Immunological tests (면역학적 테스트)
immunofluorescence(면역형광)에 의해 species-specific antigen(종 특이적 항원)은 detect(검출) 될 수 있다.
specis specific binding(종 특이적 결합)하는 antisera(항혈청)에 fluorescein isothiocyanate가 붙어있다.
이것을 cell membrane(세포막)과 mixed(섞다) 하여 incubate(배양) 한 다음 washed and mounted on slide 하면 antisera(항혈청)가 membrane(막)의 반응하는 recepter(결합자)에 binding(결합)하게 된다.
UV fluorescence microscope(방사선 형광 현미경)를 하면 positive reaction(양성 반응)이 되면 cell membrane(세포 막)에 bright green peripheral fluorescence(밝은 녹색 형광)가 나타남

4.3. Intra-species contamination (내부 종 오염)
cell line의 specis origin이 confirm(확립)되면, specis에서 derived(유래) 된 cell line 사이에서 individual(개체)을 밝히는게 중요하다.
individual genetic information(개체 유전 정보)의 most circumstance(환경)는 unique(유일)하다
--> 직접적인 genetic material(유전적 물질)의 examination(검사), genetic material의 protein product(단백질 생산물)의 investigation(탐색)으로 밝힘

4.3.1. Cytogenetics ; genome analysis (유전 분석)
banding pattern은 어느 species의 different member에서 characteristic하다.
--> individual(개체) 사이의 difference는 karyotype의 비교에 의해 recognised(확인)가 가능하다. crude한 방법

4.3.2. Recombinant DNA methods ; genome analysis (재조합 DNA 방법)
gene(유전자) 그 자체를 typing(분석) 함으로서 individual's genotype(개체의 유전자 타입)을 직접 determine(결정) 할 수 있다.

# polymorphism
여러 gene에서 specis의 individual(개체) 사이에 slight variation(약간의 차이점)이 있다.
particular gene(특별한 유전자)의 DNA에서 molecular의 difference(차이)를 말한다.
--> DNA bases(염기)의 dissimilar arrangement(다른 배열)의 존재는 각각의 individual's DNA(개체의 DNA)가 같은 restriction enzyme(제한효소)에 의해 다른 distinct length(차이가 나는 길이)의 restriction fragment(분해된 조각)이 나오는데, 이는 slight different site(약간 다른 부분)에서 잘린다는 것을 의미한다.

# RFLP ( restriction fragment length polymorphism)
이 polymorphism을 detect(찾기)하기 위해 DNA probe(탐침자)가 사용될 수 있다.
같은 제한효소로 처리해도 polymorphism에 의해 생기는 DNA fragment(조각)에서 다른 변이가 생김.

# Finger printing
a. cellular DNA
b. digestion with restriction enzyme (분해효소로 분해)
c. DNA fragment seperated (DNA 조각 분리)
d. southern blotting
e. DNA fragments transferred(옮김) to membrane (membrane의 DNA는 meltede된 즉, 반응이 가능한 상태인 single strand이다.)
f. DNA melted(녹임) and incubated(배양) with radioactive probes(방사선 탐침자)
g. probe hybridise(탐침자 혼성화) with DNA fragments carrying complementary(상보적) sequence
h. wash and place next to photographic film
i. autoradiiogram developed

4.3.3. High resolution 2-D electrophoresis
distinctive gene(특이 유전자)의 consequence는 각각 individual의 protein의 characteristic pattern으로 나타난다.
--> cell line에 의한 protein, 즉, 잘 알려진 specific protein의 probe에 의한 것과 모든 protein의 analysis를 통해 차이점을 발견할 수 있다.

a. IEF(isoelectric forcusing) - 1˚ dimension
urea 존재하에 molecular weight(분자량)과 isoelectric point를 이용하여 cell의 different protein을 일차원으로 seperate(분리) 한다.
b. SDS-page (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis) - 2˚ dimension
detergent sodium dodecyl sulfate(SDS) 존재 하에 electrophoresis(전기영동)를 한다.
protein size를 기초로 분리함.

--> single sample에서 10,000 protein을 resolve(분석) 할 수 있다.
각 cell line에 매우 specific한 fingerprint를 제공한다.

4.3.4. Allozyme analysis - allelic isoenzyme 분석
같은 specis의 다른 individual은 주어진 enzyme locus(위치)에서 다른 allele를 표현한다.
--> allozyme의 분석은 cell line의 genetic signature와 같다.
* allele : chromosome의 같은 locus에서 발견되는 gene의 다양한 form이나 다른 form

4.3.5. Blood group antigens and HL-A (human lymphocyte antigen)
* cell의 surface에 존재하는 antigen을 determination(결정) 한다.
* Blood group antigen은 primary culture에서의 normal human epithelium에서와 어떤 continuous epithelial line에 존재한다.
--> antiserum을 type하는 anti-human A, B, AB 를 사용하여 cell line의 type이 가능하다.
* major histocompatibility antigen 이나 major histocompatibility complex(HMC)
: 각각의 사람에서 immunological individuality(면역학적 개체성)에 반응하는 매우 다양한 antigen nucleated cell의 plasma membrane에 존재한다.
--> 한 individual에서 관련없는 individual에 transplanted(전달)된 tissue는 foreign으로 인식하여 recipient's immune system에 의해 제거된다.
* Human Lymphocyte Antigens(HL-A) system (=histocompatibility antigen)
chromosome(염색체)에 HL-A antigen(항체)을 coding(암호화)하는 gene(유전자)이 있다.
어떤 locus에서 gene은 항상 같지만은 않다. 각 gene의 다른 form은 allele이다.
two stage complement-dependent cytotoxicity test를 이용한 이 allele의 typing은 cell line의 identification으로 specification으로 specific system을 제공한다.

4.4. Characterisation of cell type and stage of differentiation

4.4.1. The organization of cells in vivo
* in vivo에서 cell은 tissue(비슷하게 specific function을 수행하거나 function group을 형성한 specialised cell의 group, extracellular matrix와 associated된)로 조직화된다. 각 tissue의 종류는 characteristic size, shape, arrangement의 cell로 구성된다.
* 여러 type의 tissue가 organ을 형성하고 organ은 organ system으로 arranged 된다.
* complex animal은 lymphatic system, the respiratory system, the digestive system, the endocrine system 같이 매우 다양한 organ system을 가진다.
* most cell의 surface 환경은 각 tissue에 specific한 glycoprotein과 proteoglycan의 complex mixture이다.

1. Connective tissue (=stroma, stroma cell)
* body의 tissue에 함께 join되면, body를 support, underlying organ을 protect 한다.
* extracellular matrix가 상대적으로 적은 cell이 포함되어 구성한다.
* adipose tissue, cartilage and bone, fibroblast(extracellular matrix component를 제공하는 cell)

2. Epithelial tissue
* body surface를 covering하거나 body 사이의 cavity를 lining하는 cell의 sheet나 continuous layer를 형성하기 위해 함께 tightly fitted cell로 구성된다.
* 한 sheet의 surface는 epithelial cell에서 생산하는 polysaccharide material의 tiny fibres로 구성된 non-cellular basement membrane에 의해 underlying tissue에 부착된다.
* 모양
- squamous(비늘모양) : 입이나 blood vessel의 lining
- cuboidal(입방형) : gland와 duct
- columnar(다각주형) : small intestine의 lining
- single layer(simple), two or more layer(stratified)
* 많은 epithelial cell은 milk, mucus, sweat 같은 specific product를 분비하는데 speciallised 되어 있다.

3. Muscular tissue
* contraction에 specialised된 cell로 구성
* actiin이나 myosin으로 구성된 myofibril로 불리는 contractile fibres를 포함
* cell의 location과 property에 따라 skeletal, smooth or cardiac으로 분류
smooth (internal organ, bloodvessels, duct), striated(skeleton and associated)

4. Nervous tissue
* conducting impulse나 cell을 connectiong하거나 supporting하는데 associated하는데 specialised된 cell로 구성
* brain, spinal cord, peripheral nerve, ganglia cell이 포함하고 있다.
* neuron : nervous system의 actual conducting cell, cell body, dendrites, axon으로 구성
* glial cell : connecting and supporting cell
ex. Schwan cell : peripheral nerve를 envelope하는 cell, nerve axon을 insulate하는 myelin sheath를 생산한다.

5. blood and lymph tissue
peripheral blood, bone marrow와 lymph gland에서 precusor cell
ex) 가스교환(O₂와 CO₂), immune response
erythrocyte, white blood cell (granulocyte, monocyte, lymphocyte, natural killer cell), pletelet

4.4.2. Cell division and differentiation in vivo
totipotent ovum (무엇이든 될 수 있는 상태의 cell) --> cell division and differentiation --> pluripotent stem cell (몇가지 세포로 분화가 가능한 상태의 cell) --> cell division and differentiation --> unipotent cell (한가지 cell type으로만 분화가 가능한 상태의 cell) --> cell division and differentiation --> mature differentiated cell
* young animal에선 cell multiplication이 cell death를 초과하므로 animal cell의 수가 증가한다.
* adult에선 cell division과 cell death가 steady state로 balance 한다.
* cell은 mitosis와 cell cycle에 관련된 cytokinesis를 통해 multiply 한다.
haematopoietic system에서 pluripotent undifferentiated stem cell의 small population은 terminally differentiated cell로 진행되는 commited precursor cell로 일으킬 수 있다.
terminally differentiated cell(phenotype fully expressed, 더 이상 preceed 할 수 없는 cell)로 진행되는 commintted precusor cell로 일으킬 수 있다.
stem cell : divide without limit and give rise to differentiated cells

4.4.3. Factors needed for differentiation in vivo
다른 type의 cell 사이의 interaction은 normal development 동안 differentiation을 promote하는 것과 initiating하는 것을 유발한다.
ex) epithelial precusor와 stromal precusor 간의 interaction은 epithelial differentiation을 induce 한다.
--> cell-cell interaction은 adult organism에서 differentiation 동안 role을 수행

a. hormone
endocrine glands에서 bloodstream으로 직접적으로 분비되는 intercellular signalling molecule 즉, substance를 말함 --> 다른 cell에 영향을 끼침.
* endocrine signalling : 멀리 있는 cell에도 영향을 끼침

b. paracrine factors (paracrine signalling :가까이 있는 인접한 세포에 영향을 끼침)
* bloodstream을 통해 이동하지 않는다.
* signalling cell에 가까운 target cell에 영향을 준다.
* in vivo에서 development나 differentiation에서 기능 수행

c. extracellular matrix
* collagen과 non-collagenous protein(laminin, fibronectin) 그리고 carbohydrate-rich molecule의 mixture이다.
* cellular matrix의 modification에 의해 cell differentiation이 유도된다.
ex) extracellular matrix protein인 tenascin은 stromal cell에서 합성되는데 in vivo에서 epithelial tissue의 differentiation을 유도한다.
* normal growth substratum을 형성하고 differentiation의 유도에서 essential role 수행.

d. cell-cell contact
* gap junction (intracellular communication에 중요)
개폐가 가능한 connexon이라 불리는 hexagonal protein subunit에 의해 형성된 large channel.
--> most eukaryote membrane에 존재하며, 이웃한 cell의 interior 사이의 passage way로 serve한다.(cell 사이의 ion이나 small molecule의 흐름을 허용)
∴ development나 differentiation에 필수적
* cell은 surface information의 exchange를 통해 interact한다.
한 cell의 surface에 표현된 molecule은 직접적으로 adjacent cell의 behavior에 영향을 끼친다.
connection pore를 통해 분화에 관계된 물질을 주고 받음
1000 ~ 1500 dalton보다 작은 분자들이 connexon pore을 통해 이동하여 communication 함.
ec) sugar, amino acid, vitamin, nucleotids

4.4.4. Animal cell types grown in vitro
* fibroblast (섬유아세포)
* epithelial tissue (표피조직) ; liver, lung, breast, skin, bladder, kidney cell
* neural cell (교주세포) ; glial cell, neuron(in vitro에서 proliferate 하지 못함)
* skeletal cell, cardiac cell, smooth muscle cell
* skeletal tissue ; bone cell, cartilage cell
* endocrine cell ; adrenal cell, pituitary cell, pancreatic islet cell
* melanocytes
* tumor cell

4.4.5. Differentiated state in vitro
in vitro에서 자라는 cell이 여전히 culture에서 그들의 differntiated characteristic을 가지고 있는지 confirm하는게 중요하다.

a. connective tissue
cultured fibroblast는 형태적으로 fibroblast tissue이나 differentiatied가 덜 되려는 경향이 있고 fibroblast precursor가 나타난다.
cultures fibroblast가 분화하면 adipose tissue와 connective tissue로 된다.

b. epithelial tissue
# fibroblast처럼 plastic dish에 tight하게 붙어 자란다. 그리고, laminin 같은 extracellular matrix protein도 분비한다.
# 하지만, culture에서 중요한 characteristic를 잃는다.
* differentiated product의 expression level은 hormone control을 받는다.
--> fullly differentiated epithelial cell은 culture에서 3일 사이에 tissue-specific function을 잃는다.
# De-differentiated cell은 chracteristic substrate나 다른 cell type의 존재하는 여건에서 다시 normal state로 return할 수 있다.
ex) mammary epithelial cell은 fat pad나 collagen type I gel에서 자랄때 normal ductal morphogenesis를 보이고 적당한 hormone을 첨가시 milk protein을 분비한다.
--> cell-cell과 cell-extracellular matrix interaction이 differentiation을 유도하는 soluble factor처럼 중요함
ex) skin epithelial cell은 epithelial growth factor와 다른 cell type의 feeder layer(growth증진, differentiation 증진)에서 분화유지하며 성장한다.
* feeder layer : paracrine factor와 extracellular matrix, 다른 cell type의 differentiation에 필요한 적당한 interaction을 제공하는 cell surface molecule를 제공한다.

c. Muscular tissue
# mycoblast
* permament lines of muscle precusor cell
* develop하여 certain density에 도달하면, in vivo에서와 비슷한 muscle cell function을 수행 --> 일정한 세포 농도에서 in-vivo와 유사한 기능 보임
* 서로 fuse하여 cross-striated multi-nucleated muscle fibres(myotubes) 형성

d. Nervous tissue
* in vitro에서 neural cell은 그들의 typical neural morphology를 유지한다.
* nervous system을 구성하는 glial cell과 neural의 heterogeneity는 그들의 individual subclasses의 physiology와 biochemistry를 이해하는데 장벽이 있다.

e. Blood and lymph
leukocytes(lymphocytes, monocytes, macrophage)의 precursor는 culture에서 최소한의 differentiated function을 수행한다.
ex) red blood cell의 abnormal precusor인 Erythroleukemia cell은 haemoglobin 생산을 유도하고 normal red cell maturation과 연관된 cell membrane의 structural change를 수행한다.

4.4.6. Characterisation of cell types in vitro

a. Morphology (형태)
# microscope에서 morphology 관찰
* Epithelial cell : regular, polygonal, with clearly defined edge --> 다각형
* Fibroblaste : bipolar, characteristic parallel array, whorls visible --> 양극화
# morphology는 사용한 medium과 culture돤 cell의 substrate에 변화하므로 같은 cell density, 같은 medium, 같은 substrate 같이 똑같은 growth stage를 만들어야 한다.
# 세포의 origin이 아니라 apperance로 구분한다.
* fibroblast - like = fibroblastiod
* epithelial - like = epitheleoid

b. Intermediate filament proteins
# eukaryotic cell은 cellular morphology를 유지하고 intracellular transport의 기능을 하고, cell motility, mitocis, meiosis, cytoskeleton의 필수부분을 구성하므로 cell type의 identification이라 불리는 protein netword을 포함한다.
--> cytoplasmic intermediate filament protein은 cytoskeleton의 필수부분을 구성하므로 cell type의 identification에 사용한다.
ex) cytokeratin --> epithelial cell
vimentin --> stromal cell
fibronectin --> fibroblast
desmin --> myogenic cell
neurofilament --> neuron, glial cell
∴ cell type을 구분하기 위해 다양한 intermediate filament protein에 antibody를 사용하여 immunoflurescene로 cell을 직접 stain.

c. Cell surface antigen
lymphocytes의 subspecies의 sorting에 특별히 유용하다. <-- monoclonal antibody의 availability에 의해서

d. Expression of functional properies of the mature cells.
in vivo에서 specialised function은 specific protein product의 activity를 표현한다.
ex) erythrocytes --> haemoglobin 나옴
mammary epithelial cell --> milk protein 나옴

e. Analysis of isoenzymes
# 어떤 cell line은 어느 cell type specific enzyme을 발현하지 않는다. 그러나, 어떤 housekeeping enzyme의 isoenzyme의 pattern은 cell-type마다 chatacteristic 하다.
ex) phosphoglucomutase(PGM1, 3), 6-phosphogluconate dehydrogenase(PGD), malic enzyme(ME-2), adenylate kinase(AK-1)
ex) mammal에서 두가지의 lactate dehydrogenase activity 나타내는 두가지 type의 polypeptide가 있다.
* heart tissue에 특색 : H, muscle tissue에 특색 : M --> 이것은 tertamer 형성 위해 associate한다. --> cell에서 발견되는 enzyme이다.

4.4.7. Identifying the stage of differentiation
* tissue culture에서 cell을 divide하고자 하지만, tissue는 정상적으로 proliferate하지 않는 fully differentiated cell보다 오히려 precusor cell을 represent한다. (mature differentiated cell은 divide하지 않는다.)
* in vivo의 cell은 동시에 divide ability와 어떤 differentiated product의 발현을 하지 않는다. 여전히 divide ability를 가지는 cell line은 differentiated properties를 완전히 발현하지 않는다.
* culture에는 genetically homogeneous 해도 pheonotypically heterogeneous하다. differentiation의 다른 stage의 stem cell, precursor cell, differentiated cell을 포함한다.
⇒correct enviroment를 re-creating 함으로서 cell의 pure population에서 differentiated phenotype을 re-induce해야 한다.
→ propagation과 differentiation을 위해 다른 condition이 필요하다.
cell 대량증식 → cell division stop → 적당한 inducer를 첨가하여 분화유도 → correct cell-cell 이나 cell-extracellular matrix interaction을 creating

4.4.8. Re-introducing the differentiated state in vitro
* cell culture의 궁극적 목적의 하나는 cell culture enviroment를 다른 in vitro state에서 manupulate하는데 있다.
* terminal differentiation을 향한 cell의 다른 lineage를 delay, direct, promote하는 factor를 결정하는 조건에 대한 도전
→ extracellular matrix, cell-cell interaction, soluble inducer → 분화촉진 factor

a. extracullular matrix ( in vivo에서 적절한 substrate와 비슷한 역할)
natural growth substratum을 형성, in vivo에서 static structural support cell behaviour에 영향을 미치는 distinct molecule로 구성 → 분화유도 요소
ex) mammary epithelial cell의 ductal morphogenesis에서 collagen I 은 in virtro에서 extracellular matrix의 다양한 component에 의해 differentiated state에 영향을 끼침

b. cell-cell interaction ( in vivo에서의 cell to cell contact와 비슷)
homologous cell interaction은 high cell density에서 최적으로 일어난다.
→ gap junctional communication, surface information exchange
⇒ normal developmenet 동안 differentiation을 initiating과 promoting 한다.

c. soluble inducers (hormone-endocrine signaling in vivo와 비슷)
differentiation의 physiological inducer → in vitro에서 분화유도
hormone, paracrine factor, vitamin A, inorganic ion(Ca 2+)
ex) DMSO 도 어떤 cell line의 분화를 유도한다.

4.5. Microbial contaminations

4.5.1. Bacteria, fungi, yeast
# contamination이 되면 쉽게 구분할 수 있다.
→ pH의 빠른 변화(pheonol red의 color변화로 구분), medium의 cloudiness, extracellular granularity, medium에 unidefined material의 floating
# 결점의 보완 → 배지에 항생제 첨가
* Gram positive organism의 contamination → penicillin 사용
* Gram negative organism의 contamination → streptomycin 사용
* fungi contamination → amphotericin B 나 hystatin 사용
⇒ cocktail로 만들어 medium에 첨가한다.

4.5.2. Mycoplasma
# 크기가 0.3㎛보다 작아 보이지 않는다.
# self-replicating organism, contaminated cell에 어떤 overt change 없이 proliferate한다.
# cellular biochemistry, antigenicity, growth chracteristics에 심각하게 영향을 준다.
# media, sera, trypsin, operator로부터 infected 됨
# 주기적으로 mycoplasma test 필요
# 식별방법
mycoplasma DNA는 Hoechst 33258 fluorescent dye(human cell에는 bind 안함)에 bind한다.
→ 이 dye에 stain 된 cell은 fluorescent nuclei를 가짐 → UV light에서 발광
* negative control : cell test가 추가되지 않는 control
* positive control : 알려진 mycoplasma를 고의적으로 추가한 것을 control

∴ test sample을 8 ~ 12 hr incubate → methanol : acetic acid (v/v 3:1)로 fixed → air dired → Hoechst 33258로 stained → UV incident light 사용하여 측정 → small fluorescent filament나 cocci가 존재하면 mycoplama를 지칭한다.

# DNA stain
[ Bethesda Research Laboratory market system]
① MycoTect
cell을 6-methyl purine deoxyriboside(non-toxic to mammalian cell)로 incubate ⇒ mycoplasma에 의해 6-methyl purine deoxyriboside가 metabolise되어 6-methyl purine riboside(toxic to mammalian cell)로 변한다 ⇒ 그러므로, mycoplasma가 있는 mammalian cell은 죽게 된다

② Gene-probe
mycoplasma DNA와 hybridise되는 ³H-labelled DNA probe(mammalian DNA와는 bind하지 않는다)를 사용
→ electrophoresis로 쉽게 분리 검출이 가능하다.

4.5.3. Viruses
persistent나 latent virus infection이 cell line에 존재하면, immunological, cytological ultrastructural, biochemical test가 수행되기까지 발견하지 못한다.