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전기영동
Agarose gel에 DNA와 loading dye를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠므로 매질을 타고 양전하 방향으로 움직이게 된다. 이때 움직이는 속도는 DNA의 크기, 모양에 따라 다르므로 매질내에서 종류에 따라 분리하게 되며 전기영동은 DNA의 크기, 분리, 양의 확인이 가능하다.
Metrial
전기영동장치, 전원공급장치, 50 x TAE 용액, 팁(tip), 마이크로피펫(micropippet), loading dye, DNA, size maker, agarose gel
Method
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Amount of agarose in gel(%[w/v]) |
Efficient range of separation oflinear DNA molecules (kb) |
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0.3 |
5~60 |
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0.6 |
1~20 |
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0.7 |
0.8~10 |
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0.9 |
0.5~7 |
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1.2 |
0.4~6 |
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1.5 |
0.2~3 |
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2.0 |
0.1~2 |
1. agarose와 증류수를 섞고 가열한 후 EtBr을 넣는다.
<Agarose gel 만들기>
1 x TAE용액으로 희석하여 99mL에 agarose 1g(1.0%)을 섞어서 1%로 만든다. 열을 가하여 완전 용해시키고, EtBr을 넣고 잘 섞은 후 뜨거운 용액을 식힌 후 젤을 굳히는 판에 붓고 comb을 꽂고 식을때 까지 기다린다.
2. 잘 섞은뒤 주형에 넣고 굳혀서 agarose gel을 만든다.(굳힐때는 comb를 끼워서 well을 만든다.)
3. 전기 영동 장치에 1 x TAE를 넣은 후 gel을 넣는다.
4. well의 가장 왼편에 size maker를 넣고 차례로 loading dye와 DNA를 섞은(1:5정도) solution을 주입한다.
5. 전기를 걸어준뒤 20~30분 기다린다
6. DNA가 내려오면 자외선하에서 확인한다.
* 낮은 전압에서 선형으로 된 DNA 조각의 이동속도는 부하되는 전압에 비례한다. 그러나, 전기장에서 전류의 흐름이 커짐에 따라 높은 분자량을 가진 DNA 조각의 이동속도는 빨라지게 되므로 전압이 올라감에 따라 agarose gel에서 DNA 분리 효과가 감소된다. 2 kb보다 큰 DNA 조각들의 분리를 최대로 하기 위해서는 agarose gel에 5 V/cm 이상의 전압을 부하시켜서는 안된다.
* 전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문이다.
* Gel에 ethidium bromide가 함유되어 있으면 전기영동하는 동안 어느 시기에나 자외선하에서 관찰이 가능하다. 그러나, gel에 ethidium bromide를 함유시키지 않고 전기영동한 후 gel을 ethidium bromide가 0.5 μg/ml 포함된 용액에 30~45분간 더 염색하였다가 관찰하는 것이 더 선명한 DNA 띠를 관찰할 수 있다는 이유로 후자를 선호하는 실험자들도 있다. 이 때 탈색 과정은 보통 필요치 않으나, 10 ng 이하의 적은 양의 DNA를 검출할 때에는 결합하지 않ethidium bromide가 gel에 묻어 있으면 바탕이 흐려 보이므로 증류수나 1mM MgSO4에 담가 실온에서 20분간 탈색하면 DNA를 더 선명하게 관찰할 수 있다.
<Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들>
1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.
4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.
6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.
7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.
*DNA loading dye
아가로즈의 well에 DNA를 넣어줄때 DNA용액을 무겁게 하여 아가로즈의 홈으로 가라앉하는 역할을 하며 그 성분에 전기영동되는 속도가 다른 두개의 염색시약이 들어 있어 DNA와 같이 전기영동되며 DNA의 전기영동된 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
*전기영동 buffer
TAE (Tris acetate EDTA) : DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.
TBE (Tris borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
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